乳腺癌循环肿瘤细胞单细胞转录组中MT-reads丰度反映血液来源转录本与生物学异质性而非单一质量指标

《Clinical & Experimental Metastasis》：Mitochondrial transcript abundance in breast cancer circulating tumour cells may reflect both blood-derived transcripts and biological heterogeneity

摘要：循环肿瘤细胞（circulating tumour cells, CTCs）是稀有细胞，常在单细胞水平进行分析。单细胞转录组质量的关键指标之一是由线粒体基因组（mitochondrial genome, MT）中基因编码的读数百分比（MT-reads）。目前缺乏关于CTCs中MT-reads含量的系统性数据，因此尚不清楚该参数能否可靠指示CTCs的转录组质量。研究人员收集了349个单一乳腺癌（breast cancer, BC）CTCs和129个白细胞（white blood cells, WBCs）的RNA-Seq图谱，这些细胞通过四种方法富集，以评估MT-reads水平以及最丰富血液成分——红细胞（red blood cells, RBCs）和血小板（platelets, PLTs）——标志物的表达。CTCs中PLTs和RBCs转录本的中位百分比分别为2%（0–38%）和0.8%（0.0006–84%），不同富集方法之间存在显著差异（p < 2.2^?16）。因此，44%的CTCs显示MT-reads水平超过10%，该阈值通常被认为指示低质量细胞。CTCs中MT-reads水平常与PLTs和RBCs标志物呈正相关；然在部分数据集中，升高的MT-reads与氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）和线粒体生物发生（mitochondria biogenesis）基因较高表达相关。分离的CTCs本身根据所采用的标准（BC和WBC标志物水平、非整倍体评分）表现出不同程度的癌细胞特征，这突出了CTCs鉴定的挑战。总之，单CTCs中MT-reads比例并非CTCs转录组的可靠独立指标。CTCs中MT-reads分数升高可能源于多种因素，包括血液样本处理的技术方面、血小板和红系来源转录本的潜在贡献或CTCs中发生的固有生物学过程。

论文主体解读如下。

乳腺癌（breast cancer, BC）是全球女性最常诊断的癌症，2020年有226万新病例，也是癌症相关死亡的首要原因。转移过程中，癌细胞从实体瘤进入淋巴管或血管，成为循环肿瘤细胞（circulating tumour cells, CTCs），并可在远处形成转移。外周血CTCs检测即液体活检（liquid biopsy），被视为非侵入性分析、预后和预测标志物开发、治疗反应监测及微小残留病检测的有前景工具。CTCs富集方法可分为标志物依赖型和标志物非依赖型，前者捕获癌标志物阳性细胞或去除血细胞标志物，后者利用CTCs物理特性如较大尺寸、较低变形性或特定密度。然而，CTCs稀有、异质且在血液中半衰期估计为1–2.4 h，使高质量转录组分析困难。单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）中，比对到线粒体基因组编码基因的读数百分比（MT-reads）常被用作低质量细胞识别指标；升高MT-reads常提示应激和凋亡，也可源于细胞膜损伤和胞质转录本泄漏；拟定的人细胞低质量转录组阈值为10%。但不同组织线粒体数量因代谢活性等生理特征差异显著，且缺乏CTCs中MT-reads含量的系统性数据，因此该指标能否用于CTCs转录组质量控制尚不明确。CTCs来自上皮组织，却循环于血液这一异位生态位，暴露于不同于原环境的因素。血小板（platelets, PLTs）可缓冲剪切力并保护CTCs免受自然杀伤细胞攻击；PLTs和红细胞（red blood cells, RBCs）是血液中最多的有形成分，约5 × 10⁹ RBCs/mL、1.5–4.5 × 10⁸ PLTs/mL。RBCs、RBC来源细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）及PLTs中均显示高MT-reads，PLTs功能高度依赖能量。CTCs可与RBCs、PLTs直接互作或摄取PLT来源EVs；PLTs可释放游离或EV包裹的线粒体，癌细胞可获取PLT来源线粒体并获得更强侵袭性。基于此，研究人员假设CTCs中MT-reads比例不一定仅反映细胞质量低，也可能指示CTCs固有生物学过程、CTCs与其他血液成分互作或丰富循环细胞对稀有CTCs转录组的污染。研究人员整合分析349个BC CTCs和129个WBCs，发现44% CTCs的MT-reads超过10%，CTCs中PLT和RBC标志物转录本中位分别为2%和0.8%，且MT-reads常与PLT/RBC标志物及部分数据集中OXPHOS和线粒体生物发生基因相关。结论是MT-reads不是单CTC转录组的可靠独立质量指标，应结合其他质量和生物学参数解释。这对CTCs衍生数据的方法学和转化解释具有重要意义，并提示未来CTC RNA-seq应系统评估MT-reads和血液来源转录本特征，也可用于评估CTCs分离方法性能。

为开展研究，研究人员重新分析4个公开数据集和1个本实验室队列，包括GSE75367、GSE109761、GSE210651/GSE186288、GSE143626和GSE268201，共478个单细胞，其中349个BC CTCs、129个WBCs；CTCs分别经CTC-iChip、Parsortix^TM、ClearCell^? FX和CD45 Dynabeads去除法富集；WBCs来自BC患者或健康供体，另纳入PLT pool、RBC及RBC来源EV数据。主要技术包括HISAT2比对至GRCh38.p7、featureCounts计数、R/Bioconductor归一化、DecontX污染评分、scDblFinder双细胞预测、Seurat/Harmony/UMAP整合聚类、SingleR参考图谱注释、GSEA与凋亡模块评分，以及SCEVAN和CopyKAT拷贝数推断。

结果部分，首先在收集的数据集（Collected datasets）中，研究人员整合不同BC分期、亚型、治疗状态及四种富集方法来源的478个单细胞，但原始研究预分析步骤报告不全，构成数据解释限制。其次，在原始数据集定义的单个CTCs和WBCs基因表达模式（Gene expression patterns in single CTCs and WBCs as defined by the original datasets）中，几乎所有方法分离的CTCs均可见较高MT-reads，尤其Parsortix富集的dataset 2；ClearCell^? FX/Polaris^TM来源CTCs的MT-reads、PLT/RBC转录本及检出基因数最低；PLT和RBC读数几乎存在于所有CTCs，在datasets 1、4、5中较高。GSEA凋亡签名仅在dataset 1的MT-high CTCs呈边缘富集，促凋亡基因仅在WBCs中升高；MT-reads与总归一化基因表达及MALAT1正相关，高MT-reads细胞中MALAT1更高，提示MT-reads不一定仅与转录组质量下降相关。第三，在单细胞转录组纯度水平（Single cells transcriptome purity level）中，DecontX显示微流控来源CTCs污染最低，datasets 1–4中I类纯度分别达72%、69%、98%和82%，而CD45 Dynabeads去除法仅23%；WBCs多数超过75%为I类。scDblFinder预测CTCs双细胞比例为1.87%–14.86%，但双细胞频率低且与纯度不一致，不能完全解释污染差异；同协议处理时CTCs纯度低于WBCs，提示DecontX判定的“污染”可能包括生物学相关转录本获取或内源表达。第四，在RBC和PLT转录本与MT-reads含量的关系（Analysis of RBC and PLT transcripts in relation to MT-reads content）中，PLT pool最高表达基因为MT基因和RBC基因；BC患者PLTs中MT-reads均值59.71%，健康志愿者为4.57%，但差异未达常规统计学显著性；RBC bulk中HBB/HBA2最高，MT-RNR2为第5高表达；RBC来源EVs中MT编码基因中位占15%。单CTCs中PLT/RBC基因与MT-reads多呈正相关，PLT基因尤其明显；RBC基因相关性异质且数据集特异。datasets 1、2、4中MT-reads与核编码OXPHOS基因相关，datasets 1、2及部分4中线粒体生物发生基因相关。第五，在CTCs和WBCs的UMAP聚类（UMAP clustering of CTCs and WBCs）中，Harmony校正后所有细胞形成六个主要簇，不同数据集细胞混合；参考图谱显示一簇为上皮细胞，另一簇为血小板或红细胞，支持PLT/RBC转录本贡献。按上皮和白细胞模块评分将原始标注CTCs分为“true CTCs”“potential CTCs”“potential WBCs”和“ambiguous”，其中“true CTCs”富集于上皮簇，表达ESR1和ERBB2，MT-reads最高，PLT/RBC标志物低至中等，CD71较高。第六，在从CTCs转录组推断基因组畸变（Identifying genomic aberrations from transcriptomic profiles of CTCs）中，SCEVAN判定25%（86/342）CTCs为非整倍体，CopyKAT在三个有WBC参考的数据集中判定73.8%（124/168）为非整倍体；两种方法差异大，且簇2非整倍体最高，说明从稀疏单细胞转录组推断拷贝数变异存在局限，不应直接比较绝对比例。第七，在CTCs与WBCs差异表达基因（Differentially expressed genes between CTCs and WBCs）中，原始标注CTCs与WBCs比较的前20个差异基因中10个为MT编码转录本，其中7个FDR < 0.05；还发现LPP和PATJ等黏附相关基因；仅用dataset 2的“true CTCs”与WBCs比较时，顶部差异基因仍为MT编码转录本，说明MT基因富集是CTCs转录组的稳健特征。

讨论部分总结指出，单细胞转录组学有望革新癌症研究，而CTCs是极稀有细胞。MT-reads常被用作质量指标，但阈值并不明确，若按10%阈值，大量CTCs会被判为低质量并可能被丢弃。研究人员观察到MT-reads与RBC/PLT标志物相关，而PLTs和RBCs本身高表达MT-reads，且MT-reads与MALAT1及转录组复杂性正相关，说明其并非单独反映质量差。原文讨论提出，MT-reads可能部分来自PLTs、RBCs或PLT/RBC来源EVs；PLTs含约4–10个线粒体，可与癌细胞互作、形成物理屏障并释放线粒体或EVs；RBCs成熟后无线粒体，但可能保留线粒体转录本或清除mtDNA。另一方面，CTCs中较高MT-reads或红系特征也可能为生物学获得，如Zheng et al.报道CTCs内源β-globin表达，LeBleu et al.检测到CTCs增强OXPHOS和线粒体生物发生，Sansone et al.显示EV介导的线粒体基因组摄取增加癌细胞OXPHOS。不同富集方法可能影响结果，CTC-iChip来源两个数据集显示相似RBC和MT-reads模式，Parsortix来源CTCs无高RBC/PLT但MT-reads最高，GSEA未发现其CTCs凋亡签名富集。原文强调无法区分外源技术污染和内源生物学过程，需实验验证。CTCs鉴定也具挑战，上皮标志物、白细胞标志物和拷贝数推断均有限，Gu?vic et al.显示DTCs可同时具有造血和红系标志物及基因组畸变。研究限制包括预分析信息不足、患者分期治疗不同、平台差异及样本量限制，不能直接比较非整倍体绝对数量。

研究结论翻译：总之，研究人员表明，PLT和RBC特征性转录本可显著贡献于单CTCs转录组谱。在所有数据集中，CTCs中PLT和RBC标志物转录本的中位百分比分别为2%（范围：0–38%）和0.8%（范围：0–82%）。据研究人员所知，这是首项表明CTCs分析在按MT-reads评估转录组质量时可能需要不同标准的研究。研究人员观察到MT-reads与PLT、RBC标志物基因以及核基因组编码的提示线粒体生物发生和OXPHOS的转录本之间存在关联。研究人员的推测（需实验验证）是，MT-reads可能来自不同来源——癌症细胞在转移过程中发生的固有变化（例如CTCs中线粒体活性增加）、捕获其他细胞类型（如PLTs和RBCs）的转录本，或环境RNA水平。因此，MT-reads丰度可能不是单CTC转录组的可靠独立质量指标，应与单细胞的其他质量和生物学参数一起解释。这些发现对CTCs衍生数据解释的方法学和转化方面具有重要意义。未来CTC RNA-seq分析应系统评估MT-reads和血液来源转录本特征（例如PLT/RBC标志物），以改善对CTCs生物学的解释。研究人员的结果还表明，单细胞转录组谱可能有助于评估CTCs分离方法和方案的性能，这可能有助于进一步开发分离纯净、高质量CTCs的工具。研究人员希望该结果能成为讨论制定和实施指南的起点，以纠正CTC分析领域观察到的局限。