基于图像分割任意模型（SAM）与光密度光谱分析的微藻细胞壁完整性检测两种新方法

《Journal of Applied Phycology》：Two novel methods of testing microalgae cell wall integrity using image based segment anything model or optical density spectrum analysis

　　

微藻细胞的破碎以获取有价值的胞内化合物是工业上的一个瓶颈。筛选具有低细胞完整性的物种可以降低这一成本，但目前适用的快速方法有限。本研究探索了两种评估不同微藻物种细胞完整性的新方法：一种基于图像的分析方法，利用分割任意模型（Segment Anything Model, SAM）从显微图像中量化细胞计数和尺寸分布；另一种是全光谱光密度（optical density, OD）分析方法，用于追踪细胞破碎过程中的变化。细胞破碎由超声处理诱导，并以指数衰减速率常数（k）作为主要比较指标进行量化，同时将D95（达到95%破碎的时间）作为一个直观的度量。SAM方法与参考方法（即在不同超声时长后使用颗粒计数器计数细胞大小的颗粒）表现出良好的一致性，尽管对较小细胞的灵敏度有所降低。光学方法捕捉到了物种的排序，但在绝对的k值上存在偏差，反映了物种依赖的光学效应。通过参考方法比较各物种在细胞破裂难易程度方面的衰变速率k：Tetraselmis suecica（k = 0.097 min-1）、Isochrysis galbana（k = 0.255 min-1）、Nannochloropsis oceanica（k = 0.002 min-1）和Chaetoceros gracilis（k = 7.706 min-1），结果显示Chaetoceros gracilis极易被破碎，而Nannochloropsis oceanica几乎不受影响。

研究背景与目的

微藻作为一种可持续的高价值化合物来源（包括脂类、蛋白质和色素），在水产饲料、食品、营养和生物技术领域具有广阔的应用前景。然而，微藻生产仍面临关键技术挑战，其中破碎微藻细胞以获取胞内化合物的过程成本高昂且能耗巨大，尤其是对于具有坚固细胞壁的物种而言，这已成为制约产业经济可行性的重要瓶颈。解决此问题的策略之一是筛选或鉴定具有固有低细胞完整性的物种或菌株，从而从源头上降低下游加工成本。为此，亟需开发可规模化、广泛实施（即可用廉价常用设备完成）的快速细胞完整性评估方法。基于此，本研究旨在探索两种新颖的替代性方法，以实现对微藻细胞破碎过程的快速、可扩展评估。

研究方法与技术

研究人员采用的主要关键技术方法包括：

1. 1.
   图像分析与分割任意模型（Segment Anything Model, SAM）：利用计算机视觉领域的SAM模型，对经过不同时长超声处理的微藻显微图像进行自动化对象检测与分割，进而量化细胞计数和尺寸分布，并据此计算衰变速率。
2. 2.
   全光谱光密度（optical density, OD）分析：使用分光光度计测量经超声处理后样品在320–1100 nm范围内的全光谱吸光度，通过对归一化后的光谱进行分析，选取特定波段（1000–1100 nm）的平均吸光度变化来追踪细胞破碎进程。
3. 3.
   参考方法（颗粒计数器法）：使用贝克曼库尔特Multisizer 4e颗粒计数器，通过测量指定粒径范围内的颗粒浓度变化，作为评估细胞破碎的金标准参考方法。
4. 4.
   数据建模与统计分析：将实验数据拟合至指数衰减或先升后降等模型，以推导出表征细胞破碎速率的衰变常数k，并运用方差分析（ANOVA）等统计方法评估不同因素（如物种、方法、超声时长）的显著性影响。

研究结果

1. 颗粒计数器与显微镜验证

• •
  超声影响、细胞破碎率（k）、D₅₀与D₉₅：通过颗粒计数器分析发现，随着超声处理时间的增加，四种微藻物种在各自对应粒径范围内的颗粒浓度均呈现下降趋势，表明细胞发生破碎。对于I. galbana，初期观察到细胞浓度短暂上升，研究人员将其归因于细胞聚集体的解聚。通过模型拟合，获得了各物种的衰变速率k值。结果显示，C. gracilis最易破碎（k=7.706 min^-1），不到一分钟即可基本完全破碎；I. galbana和T. suecica则需要12到30分钟；而N. oceanica几乎未受影响（k=0.002 min^-1）。统计分析证实，物种显著影响衰变常数k。
• •
  显微镜验证：显微图像直观证实了上述发现。T. suecica随超声时间延长碎片增多，并在最初5分钟内发生细胞对分离。I. galbana的细胞聚集体在30秒内分散，随后出现碎片和细胞数量减少。C. gracilis在5秒内即开始碎裂。N. oceanica则在整个超声过程中形态基本保持不变。

2. SAM显微成像方法

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  SAM分割与细胞浓度估算：SAM方法在不同物种上的表现存在差异。其对T. suecica的检测较为准确，但随着超声时间增加，会误将细胞碎片簇识别为完整细胞。而对于较小的物种（如N. oceanica和C. gracilis），SAM存在明显的欠分割问题。与颗粒计数器相比，SAM得出的T. suecica和I. galbana浓度偏高，而N. oceanica和C. gracilis浓度偏低。
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  超声影响、细胞破碎率（k）、D₅₀与D₉₅：SAM方法得出的细胞尺寸分布与参考方法总体趋势一致，但未显示T. suecica和I. galbana初始的大颗粒峰，表明其能更好地区分细胞聚集体。然而，SAM数据显示T. suecica在约20分钟时出现一个约5微米的颗粒密度峰，这可能源于将碎片误分类为细胞。该方法的数据点离散度较大，模型拟合优度（R²）相对较低（0.78, 0.64, 0.09）。

3. 光密度光谱分析（320–1100 nm）

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  光谱分析与细胞浓度外推：原始OD光谱显示，超声处理引起总吸光度和光谱分布的变化，但存在物种间差异。T. suecica和C. gracilis在光谱范围内吸光度增加，这与碎片增多相关。光谱归一化后，有效抑制了碎片的散射贡献，使得光谱变化更平滑。
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  超声影响、细胞破碎率（k）、D₅₀与D₉₅：归一化后在1000–1100 nm波段的平均吸光度随超声时长呈衰减趋势，与参考方法的曲线形状相似，但数据不趋向于零而是稳定在一个基底水平。采用带偏移的衰减模型进行拟合，获得了良好的拟合效果和较低的离散度。该方法得到的物种k值排序与参考方法一致，且对于N. oceanica也显示出显著的统计学差异（p=0.0041），模型拟合优度很高（R²=0.92）。

4. 方法比较

三种方法对物种破碎难易程度的排序是一致的。SAM方法倾向于低估k值，而OD方法通常高估k值（N. oceanica除外）。模型拟合优度方面，SAM方法最低。值得注意的是，对于N. oceanica，颗粒计数法和SAM法的拟合效果都很差（R²分别为0.07和0.09），但OD法却表现出色（R²=0.92）。统计分析表明，物种和测量方法均显著影响k值，且两者之间存在显著的交互作用，意味着不同方法间的吻合程度因物种而异。

讨论与结论

讨论部分指出，由于不同研究中方法学差异巨大（如能量输入指标不统一），直接将本研究结果与现有文献进行定量比较存在困难。唯一可比的定性观察结果是Nannochloropsis比Isochrysis更难破碎，这与前人报告一致。研究人员认为，基于SAM的图像分析方法是最稳健且可及性最高的方法，因为它能利用普通显微镜甚至智能手机等广泛平台直接量化完整细胞和碎片。该方法可通过增加采集图像数量以提高计数精度，并可借助针对细胞检测优化的分割模型来改善对小细胞的分割效果。相比之下，OD测量的稳健性较差，因为超声引起的复杂散射和吸收变化使得光谱轮廓缺乏规律性。在超清液中测量OD可能是一个规避复杂散射效应的潜在途径，但这会增加样品制备步骤。

研究结论总结如下：本研究表明，可以使用替代性的、可扩展的方法实现对微藻细胞完整性的快速评估。基于SAM的图像分析为细胞破碎提供了最可靠的代理指标，与参考方法高度一致，同时提高了可及性和通量。相比之下，全光谱光密度测量虽能捕捉到相对趋势，但其应用受限于物种特异性的光学响应。结果进一步突显了不同微藻物种在破碎敏感性上的巨大差异，强调了菌株选择作为降低下游加工成本策略的重要性。总体而言，集成自动化成像方法为高效筛选适用于工业应用的微藻提供了一条有前景的路径，未来在分割算法和数据分析上的改进有望进一步提升其准确性和鲁棒性。