流变学作为昆虫细胞-杆状病毒系统生化参数监测工具的可行性评估

《Biotechnology Letters》：Rheology as a monitoring tool for the biochemical parameters of insect cell-baculovirus system

专业术语翻译（摘要部分） 目的：过程分析技术（Process Analytical Technology, PAT）工具日益被应用于改进生物制药过程的监测；然而，基于昆虫细胞培养的液态生物过程中，鲜有技术探索其应用。本研究评估了在利用昆虫细胞–杆状病毒表达系统（insect cell–baculovirus expression vector system）生产病毒样颗粒（virus-like particle, VLP）过程中，流变学参数是否可作为生化变量的监测指标。 方法：在未感染条件下以及狂犬病和SARS-CoV-2病毒样颗粒（VLP）生产过程中，开展了草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda, Sf9）细胞的批次生物反应器培养。通过稳态剪切锥板流变测定法（steady-shear cone-plate rheometry）测定流变学性质，并将其与活细胞密度（viable cell density, Xv）、总细胞密度（total cell density, Xt）、胞外蛋白浓度（extracellular protein concentration, EP）及病毒滴度（viral titer, VT）进行关联。采用赤池信息准则（Akaike’s Information Criterion, AIC）生成并排序经验模型，预测性能通过均方根误差（root mean square error, RMSE）评估，统计学显著性通过方差分析（analysis of variance, ANOVA）检验。 结果：所有培养物均表现出非牛顿型、假塑性（pseudoplastic）行为，流动行为指数（flow behavior index, n）的降低与细胞密度和蛋白浓度的增加相关。在排名最优的经验模型中，指数函数（exponential functions）被最频繁选中，其次为有理函数（rational）、双曲函数（hyperbolic）、对数函数（logarithmic）和幂函数（power equations）。流变学参数或感染条件对预测精度均无统计学显著影响（p > 0.05）。 结论：流变学性质反映了昆虫细胞培养过程中发生的组成变化；然而，在所研究的条件下，流变学并未显著改进关键生化参数相对于其他方法的定量监测。这些发现表明，尽管流变学可提供补充性的过程信息，但在其作为VLP生产的稳健PAT工具应用之前，仍需进一步研究。

论文解读

一、研究背景与问题提出

生物制药上游过程的监测对于确保产品质量和过程性能至关重要。目前，拉曼光谱（Raman spectroscopy）和红外光谱（Infrared spectroscopy）等光谱技术已被广泛用作过程分析技术（Process Analytical Technology, PAT）工具，能够在产品生成全过程中提供关键参数的准确测量。然而，这些技术应用于昆虫细胞培养的液态生物过程时，仍面临诸多挑战。昆虫细胞–杆状病毒表达载体系统（insect cell-baculovirus expression vector system, BEVS）是生产病毒样颗粒（virus-like particle, VLP）等重组蛋白产品的重要平台，已被用于开发多种疫苗。但该系统的复杂性——包括细胞生长动力学、最佳感染时间、感染时细胞浓度、感染复数（multiplicity of infection, MOI）等因素——使得过程监测和优化尤为困难。

流变学性质描述了流体对外加力的响应，能够反映样品的化学组成以及生物催化剂（如宿主细胞和病毒）的形态特征。已有研究表明，非牛顿流变学特性会显著影响悬浮细胞培养中生物反应器的剪切应力定量。然而，截至目前，文献中尚未建立将流变学参数与昆虫细胞培养过程中生化数据相关联的监测方法。大多数相关研究集中于固体生产、生物材料分析（如血液样本）、植物/细菌/哺乳动物细胞培养中的力学作用及代谢物浓度对流变学的影响，以及聚合物生产中流变学性质的评估。因此，本研究旨在评估流变学参数作为昆虫细胞培养（含病毒感染与未感染条件）监测工具的可行性，以狂犬病和SARS-CoV-2病毒样颗粒（VLP）生产作为生物制药上游过程的模型。

二、研究内容与主要结论

研究人员开展了三项批次生物反应器实验：第一项为未感染条件下的培养（工作体积500 mL，历时约160小时，采集14个样本）；第二项为SARS-CoV-2重组杆状病毒（RBV-S-S MOI 3和RBV-S-M MOI 2）感染实验（工作体积400 mL，历时约125小时，采集12个样本）；第三项为狂犬病重组杆状病毒（RBV-R-G MOI 3和RBV-R-M MOI 2）感染实验（工作体积400 mL，历时约150小时，采集14个样本）。所有实验均在Minifors 2生物反应器中进行，温度28°C，搅拌转速80 rpm，气体流速0.1 vvm，30%空气饱和度。

研究得出以下主要结论：所有培养物均表现出非牛顿型、假塑性（pseudoplastic）行为，流动行为指数（flow behavior index, n）随细胞密度和蛋白浓度的增加而降低。未感染批次中，稠度指数（consistency index, k）随细胞密度和蛋白浓度增加而升高。然而，粘度变化并未严格跟随细胞密度、蛋白或病毒滴度值的变化。在模型选择方面，指数函数（exponential functions）最为频繁地被选为最优经验模型，其次为有理函数（rational）、双曲函数（hyperbolic）、对数函数（logarithmic）和幂函数（power equations）。方差分析（ANOVA）结果表明，流变学参数（k、n或表观粘度μ_app）和生物反应条件（感染与否）对活细胞密度、总细胞密度、胞外总蛋白浓度和病毒滴度的监测精度均无统计学显著影响（p > 0.05）。

三、主要关键技术方法

本研究采用的关键技术方法包括：稳态剪切锥板流变测定法（steady-shear cone-plate rheometry），使用Anton Paar MCR 92流变仪，在28°C下进行剪切速率从0.1到100 1/s的扫描（每样本21个数据点）；幂律模型（power-law model, τ = k × γⁿ）用于确定稠度指数（k）和流动行为指数（n）；赤池信息准则（Akaike’s Information Criterion, AIC）用于经验模型排序和选择；均方根误差（root mean square error, RMSE）用于评估预测性能；主效应方差分析（Main Effects ANOVA）及Tukey HSD事后检验用于统计显著性评估。样本来源包括草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda, Sf9）细胞（ATCC1711）和Sf9 Easy Titer（Sf9 ET）细胞系（由美国Frederick国家癌症研究所蛋白质表达实验室提供）。病毒滴度测定使用Sf9 ET细胞，总蛋白定量采用Pierce? Bradford Plus蛋白测定试剂盒，VLP表征通过透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）完成。

四、研究结果

流变学行为表征：含细胞样本的流动行为指数（n）分析显示，除SARS-CoV-2重组杆状病毒感染批次中的一个样本外，所有样本均表现出剪切变稀的假塑性行为（n < 1）。未感染批次中稠度指数（k）随细胞密度和蛋白浓度增加而升高。感染批次中，病毒滴度与澄清样本的流变学参数关联分析表明，感染样本同样表现出非牛顿型假塑性行为，但该行为与粘度变化并无对应关系。

经验模型选择：通过Origin软件Rank Model工具，采用AIC为每个生化参数与流变学参数的对应关系选择最优模型。在所有模型中，仅指数、幂、有理、对数和双曲函数被选中。指数函数是最常用的关联方程。部分模型虽AIC值较低，但可能因样本量不足导致过度参数化而出现建模错误。

统计显著性分析：主效应方差分析（ANOVA）结果表明，流变学参数（k、n、μ_app）和生物反应条件（感染与否）对活细胞密度、总细胞密度、胞外总蛋白和病毒滴度的监测均无显著影响（p > 0.05）。尽管AIC已考虑样本量和方程参数，模型仍呈现较高的RMSE”值，与光谱方法监测VLP生产的误差相比偏高。然而，RMSE分析显示，对于活细胞密度（X_v）、总细胞密度（X_t）和胞外蛋白浓度（EP），预测能力处于这些生化变量定量技术的预期分析误差范围内。病毒滴度（VT）的流变学预测精度低于荧光滴定法，但RMSE建模值低于拉曼光谱监测病毒颗粒的报道值。

五、讨论与结论

讨论部分指出，模型误差可能与非牛顿流体建模的固有困难、样本量有限（部分分析因数据库较小而出现错误信息）以及感染过程中细胞裂解释放多种蛋白质到胞外培养基等因素相关。研究人员建议后续研究需采集更多样本以建立更强的相关性。透射电子显微镜（TEM）表征确认了SARS-CoV-2 VLP（平均粒径185.72 nm）和狂犬病VLP（平均粒径107.89 nm）的成功生产。

研究结论翻译如下：本研究结果表明，昆虫细胞生长和杆状病毒感染以获得VLP的实验中，感染前和感染后阶段均表现为具有假塑性特征的非牛顿流体，这与其他发酵培养物随细胞密度增加而表现出的行为一致。在建立流变学与生化参数关系模型时，单参数指数函数最为常用，其次为有理、双曲、幂和对数函数。然而，使用更大数据集进行进一步研究有助于建立更准确的参数关联。此外，分析表明流变学参数或感染条件对所有生化监测均无显著影响，因为RMSE”值在统计学上是相等的。