ZC3H15在人类肿瘤中的泛癌探索：临床意义、分子功能及与肿瘤免疫微环境的关联并肝癌验证

《Frontiers in Immunology》：ZC3H15 in human tumors: a pan-cancer exploration of its clinical significance, molecular function, and association with the tumor immune microenvironment

　　

背景：锌指CCCH型蛋白15（ZC3H15）是一种核糖体相关真核蛋白，参与多种生物学过程，包括基因表达调控、翻译和免疫调节。尽管ZC3H15已被认为与某些肿瘤的发展相关，但其在泛癌背景下的表达、功能相关性、诊断潜力和预后价值仍未完全阐明。本研究对33种癌症类型中的ZC3H15进行了整合、系统且比较性的分析，并随后在肝癌中提供了进一步的实验验证。方法：ZC3H15的信使RNA（mRNA）表达数据来自癌症基因组图谱（TCGA）和基因型-组织表达（GTEx）数据集。蛋白水平验证使用人类蛋白图谱（HPA）数据库和临床蛋白质组肿瘤分析联盟（CPTAC）数据库进行。cBioPortal数据库用于分析ZC3H15的基因组改变。研究人员进行了两种通路富集分析方法，以探索ZC3H15在泛癌中的生物学功能和分子机制。结果：结果表明，ZC3H15在广泛肿瘤中过表达。在某些癌症，尤其是肝细胞癌（LIHC）、肺腺癌（LUAD）、乳腺浸润性癌（BRCA）、肺鳞状细胞癌（LUSC）和头颈部鳞状细胞癌（HNSC）中，其表达与患者不良预后显著相关。突变和扩增是ZC3H15最常见的基因改变。基因集癌症分析（GSCA）数据库显示，在大多数肿瘤类型中甲基化水平降低。ZC3H15异常表达与免疫细胞浸润相关。基因富集分析表明，与肿瘤进展相关的ZC3H15相关基因显著富集于多个细胞周期过程。研究人员证明，在两种肝癌细胞系MHCC97H和Huh7以及两种BRCA细胞系MDA-MB-231和Hs 578T中，敲低ZC3H15可抑制细胞增殖、迁移和侵袭。为进一步阐明功能机制，后续免疫荧光染色证实，在MHCC97H和Huh7肝癌细胞中，ZC3H15敲低诱导前中期（prometaphase）阻滞。结论：总体而言，这项泛癌研究表明，ZC3H15可作为癌症诊断、预后和免疫细胞浸润的潜在生物标志物。

研究背景：癌症是复杂且异质性疾病，仍是全球死亡的主要原因。传统上癌症按组织起源分类，但不同癌种在发生率、死亡率和分子机制上差异显著，同时又有共同分子通路和治疗靶点。泛癌研究通过比较多种癌症共同特征，有助于发现普遍致癌机制及诊断或预后标志物，如循环肿瘤DNA和肿瘤突变负荷（TMB）。ZC3H15是一种高度保守的核糖体相关真核蛋白，参与基因表达调控、翻译和信号转导。既往研究显示，ZC3H15在肝细胞癌中与TNF受体相关因子2（TRAF2）相互作用激活核因子-κB（NF-κB）通路，促进肿瘤生长和血管侵犯；在胃癌中通过抑制FBXW7转录增加c-Myc稳定性，促进增殖、迁移和侵袭；在胶质母细胞瘤中下调Casitas B-lineage（CBL）稳定表皮生长因子受体（EGFR）；在急性髓系白血病中过表达并影响NF-κB通路；在黑色素瘤中高表达与较差生存相关。ZC3H15还参与免疫反应、氧化应激和炎症过程。然而，跨恶性肿瘤的比较研究仍少，尤其从泛癌角度评估其诊断和预后潜力尚不充分。因此，研究人员开展泛癌分析，并在肝癌和乳腺癌细胞中进行实验验证。

关键技术方法：数据来源包括TCGA和GTEx的33种癌症队列，GEO中LIHC GSE14520、LUAD GSE32863、BRCA GSE15852、LUSC GSE74706和HNSC GSE30784，以及HPA、CPTAC、cBioPortal、GSCA、UALCAN、GEPIA和TIMER2.0。采用差异表达、Cox回归、Kaplan-Meier、受试者工作特征（ROC）曲线、ESTIMATE、单样本基因集富集分析（ssGSEA）、基因集富集分析（GSEA）及基因本体论（GO）/京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集。实验使用MHCC97H、Huh7、MDA-MB-231和Hs 578T细胞，以小干扰RNA（siRNA）敲低ZC3H15，并行CCK-8、Transwell、流式细胞术、Western blot、EdU和免疫荧光。

研究结果：
1. ZC3H15基因在人类癌症中的表达：基于GTEx发现ZC3H15在正常组织中组织特异性低、广泛表达；TCGA显示其在BRCA、胆管癌（CHOL）、结肠腺癌（COAD）、食管癌（ESCA）、HNSC、LIHC、LUAD、LUSC、直肠腺癌（READ）和胃腺癌（STAD）等升高，在肾嫌色细胞癌（KICH）、肾乳头状细胞癌（KIRP）、肾透明细胞癌（KIRC）和甲状腺癌（THCA）等降低；TCGA与GTEx联合及配对分析进一步显示多种癌上调，少数癌如KICH、THCA下调。结论为ZC3H15在多种癌症中上调，在少数癌症中下调。
2. ZC3H15表达及其与泛癌临床病理的相关性：利用UALCAN分析发现，ZC3H15表达与LIHC、LUAD、HNSC、LUSC等病理分期显著相关；在LIHC、LUAD、HNSC、LUSC、子宫内膜癌（UCEC）、肾上腺皮质癌（ACC）、KIRP和葡萄膜黑色素瘤（UVM）中随分期升高，在间皮瘤（MESO）、KICH、KIRC、卵巢浆液性囊腺癌（OV）、THCA和睾丸生殖细胞肿瘤（TGCT）中随分期降低。肿瘤分级方面，LIHC、HNSC、胰腺腺癌（PAAD）和STAD中随分级升高，KIRC中降低；淋巴结转移方面，LUAD、BRCA、LUSC、CHOL和KIRP中随N分期升高。
3. ZC3H15的诊断价值及其对泛癌预后的影响：ROC分析显示其对13种癌症具诊断潜力，曲线下面积（AUC）>0.7，其中CHOL为0.994，STAD为0.895，LUSC为0.89，ESCA为0.863，COAD为0.871，LIHC为0.83，LUAD为0.814，READ为0.778，BRCA为0.701，HNSC为0.715，胶质母细胞瘤（GBM）为0.716，KICH为0.715，THCA为0.731。单因素Cox回归显示，高表达与LIHC、LUAD、BRCA、PAAD、低级别胶质瘤（LGG）、宫颈鳞癌和腺癌（CESC）、UCEC、前列腺腺癌（PRAD）、MESO、KIRP、KICH和ACC较差总生存期（OS）相关，与READ、OV、子宫癌肉瘤（UCS）和KIRC较好OS相关；高表达与LIHC、LUAD、HNSC、LUSC、PAAD、CESC、UCEC、PRAD、KIRP、KICH和ACC较差无进展间期（PFI）相关，与OV、UCS和KIRC较好PFI相关；高表达与LIHC、LUAD、HNSC、PAAD、LGG、膀胱尿路上皮癌（BLCA）、CESC、UCEC、MESO、KIRP、KICH和ACC较差疾病特异性生存期（DSS）相关，与OV和KIRC较好DSS相关。多因素Cox回归显示，ZC3H15是LIHC OS独立预后因素（风险比HR=1.747，95%置信区间CI：1.130–2.700，p=0.012）和DSS独立预后因素（HR=1.662，95% CI：1.000–2.762，p=0.050），但不是PFI独立因素；在LUAD中均非独立；在BRCA中是OS独立因素（HR=1.679，95% CI：1.168–2.413，p=0.005）；在LUSC中是PFI独立因素（HR=1.502，95% CI：1.018–2.214，p=0.040）；在HNSC中是PFI独立因素（HR=1.450，95% CI：1.079–1.950，p=0.014）和DSS独立因素（HR=1.462，95% CI：1.020–2.096，p=0.039），但非OS独立因素。针对上述终点构建六个列线图，校准曲线显示1、3、5年预测与观察生存概率具有良好一致性。
4. ZC3H15在人类癌症中的蛋白水平及诊断价值：HPA显示ZC3H15在正常组织广泛高表达，免疫组化中部分癌组织强阳性而对应正常组织弱或无信号；CPTAC显示ZC3H15蛋白在LIHC、LUAD、BRCA、HNSC、LUSC、COAD、GBM、UCEC和OV中升高，在KIRC和胰腺导管腺癌（PDAC）中降低；在LIHC、LUAD、BRCA、HNSC和LUSC中蛋白上调，尤其BRCA具明显诊断价值。
5. ZC3H15在泛癌中的遗传变异、拷贝数变异和甲基化分析：cBioPortal分析32种癌症，ZC3H15改变主要为突变和扩增，UCEC突变频率最高为5.48%；表达随拷贝数变异（CNV）从纯合缺失到高扩增而增加。TMB分析显示多数癌症中突变频率低；ZC3H15表达与TMB在STAD、LUAD和皮肤黑色素瘤（SKCM）正相关，在THCA负相关；与微卫星不稳定性（MSI）在LUSC和STAD正相关，在弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBC）和嗜铬细胞瘤及副神经节瘤（PCPG）负相关。GSCA显示除CHOL、胸腺瘤（THYM）、UCEC、GBM、THCA和ACC外，ZC3H15 mRNA与甲基化水平显著相关，OV和TGCT中强负相关，DLBC、READ、KICH、CESC、UCS和ESCA中弱负相关；UALCAN显示大多数肿瘤启动子区低甲基化。结论提示ZC3H15可能受CNV、启动子甲基化和遗传改变影响，但TMB数据未显示其与整体基因组不稳定性密切关联。
6. ZC3H15基因与免疫浸润的关系：ESTIMATE显示多数癌症中ZC3H15表达与肿瘤微环境免疫成分负相关，并与TGCT、LUSC和肉瘤（SARC）等基质评分显著负相关。MCPcounter、TIMER和quanTIseq均提示ZC3H15与中性粒细胞浸润正相关；MCPcounter和TIMER提示其与巨噬细胞浸润正相关；XCell和ssGSEA提示多数癌种中与Th2细胞正相关、与Th1细胞负相关。TIMER2.0显示ZC3H15与CXCL8在26种癌症正相关，与CXCL10在21种癌症正相关，与CXCL11在21种癌症正相关，与CCR1和CCR8在25种癌症正相关；并与14种免疫激活因子和4种免疫抑制因子在超过20种肿瘤中正相关。结论为ZC3H15可能对肿瘤免疫具有复杂调控作用。
7. ZC3H15在人类癌症中潜在功能和通路的GSEA分析：GEO数据验证ZC3H15在LIHC、LUAD、BRCA、LUSC和HNSC中显著升高。GSEA显示高、低ZC3H15患者差异基因共同富集于细胞周期相关通路，包括G₁/S期、DNA复制和有丝分裂相关通路；还激活纺锤体形成、中心体形成和组装、姐妹染色体分离、胞质分裂及多种细胞骨架相关通路。GEPIA共表达基因GO/KEGG分析支持mRNA加工、核糖核蛋白复合体生成、翻译起始、DNA复制、染色体分离、有丝分裂纺锤体组织、Arp2/3复合体介导肌动蛋白成核正调控和有丝分裂核分裂等过程，KEGG富集于剪接体、真核核糖体生成和细胞周期。结论为ZC3H15可能通过DNA复制、有丝分裂和肿瘤免疫微环境影响肿瘤进展。
8. ZC3H15敲低抑制肝癌和乳腺癌细胞体外增殖、迁移和侵袭：三条siRNA均有效降低ZC3H15；CCK-8显示敲低显著抑制MHCC97H和Huh7肝癌细胞及MDA-MB-231和Hs 578T乳腺癌细胞增殖；Transwell显示显著抑制迁移和侵袭。流式细胞术显示肝癌细胞发生G₂/M期阻滞；EdU显示DNA复制无显著减少；pH3和α-tubulin免疫荧光显示pH3阳性细胞比例降低，早期有丝分裂比例显著升高，提示前中期阻滞，说明ZC3H15可能不参与DNA复制而影响早期有丝分裂。CCNB1在五种癌症中均与ZC3H15正相关，CDK1也正相关。Wu et al.近期在非小细胞肺癌中显示ZC3H15经TRIM56促进PTEN泛素化并激活AKT/mTOR；本研究中Huh7细胞中ZC3H15显著激活该通路，MHCC97H中未激活。结论为ZC3H15可能通过调节细胞周期蛋白促进增殖，并通过细胞骨架动力学促进迁移和侵袭。

讨论部分总结：泛癌研究有助于识别肿瘤分子标志物和信号通路。ZC3H15在多种肿瘤中高表达并与不良预后相关，本研究扩展了其在LUAD、BRCA、HNSC、LUSC、READ、ESCA、COAD和CHOL等癌种中的证据。TCGA与TCGA+GTEx结果差异可能与TCGA正常样本量小有关。肿瘤微环境中，ZC3H15与免疫和基质成分总体负相关，但与中性粒细胞、巨噬细胞、Th2及多种趋化因子和免疫调节因子正相关，提示复杂调控。机制上，GSEA、GO/KEGG和细胞实验共同提示ZC3H15主要影响细胞周期和有丝分裂早期，CDK1/cyclin B1复合物可能参与其中；siRNA存在脱靶和瞬时沉默局限，研究使用三条siRNA并在7天内完成实验。研究局限包括数据来自不同数据库可能产生选择偏倚，免疫浸润关系主要依赖生物信息学预测而缺乏充分实验验证。

研究结论翻译：ZC3H15表达在多种恶性肿瘤中与若干临床特征相关。在某些癌症中，较高表达预示较差的OS、DSS和PFI，并且与多种免疫细胞浸润相关。敲低ZC3H15可抑制肝癌和乳腺癌细胞系的细胞增殖、迁移和侵袭。通路富集分析和后续肝癌细胞实验证明，ZC3H15主要通过调控有丝分裂早期阶段促进肿瘤进展。该研究表明，ZC3H15可能是肿瘤诊断、免疫细胞浸润和预后的有价值生物标志物。