《Frontiers in Immunology》：Machine learning-derived R-loop-related diagnostic signature for psoriasis: a multi-cohort and single-cell validation study
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背景：银屑病是一种慢性炎症性皮肤病，其特征为免疫应答失调和角质形成细胞（keratinocyte, KC）过度增殖。尽管治疗策略已显著进展，实现持久长期缓解仍具挑战。R-loop是三链核酸结构，参与多种疾病的基因组稳定性与炎症调控；然而，其在银屑病中的作用仍知
背景：银屑病是一种慢性炎症性皮肤病，其特征为免疫应答失调和角质形成细胞（keratinocyte, KC）过度增殖。尽管治疗策略已显著进展，实现持久长期缓解仍具挑战。R-loop是三链核酸结构，参与多种疾病的基因组稳定性与炎症调控；然而，其在银屑病中的作用仍知之甚少。
目的：探究R-loop在银屑病中的参与情况，构建R-loop相关诊断特征，并鉴定疾病发病机制的关键分子驱动因子。
方法：整合五个公共批量RNA表达队列（GSE30999、GSE41664、GSE13355、GSE6710和GSE14905）和一个单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据集（GSE173706）的转录组数据，用于分析银屑病皮损与非皮损皮肤样本。鉴定R-loop相关差异表达基因，并使用Elastic Net机器学习算法构建R-loop相关诊断特征（R-loop-related diagnostic signature, RRDS）。采用三种互补分析方法评估模型性能，并进行SHapley Additive exPlanations（SHAP）分析以量化单个基因的贡献。进一步分析scRNA-seq数据以在细胞水平验证发现。此外，通过siRNA介导的敲低、定量实时PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）和Cell Counting Kit-8（CCK-8）实验在HaCaT细胞中检测SRPK1的生物学功能。
结果：与未受累皮肤相比，银屑病皮损中R-loop活性显著升高。研究人员建立并验证了一个八基因RRDS，其可准确区分银屑病皮肤与健康皮肤。SHAP分析确定SRPK1是诊断模型中最具影响力的特征。单细胞分析进一步将SRPK1定位于角质形成细胞分化关键阶段的致病性KC_4亚群。HaCaT细胞中的功能验证通过qRT-PCR证实SRPK1被有效敲低，并表明SRPK1沉默在96小时内显著抑制角质形成细胞增殖，经CCK-8实验确定（P < 0.001）。
结论：本研究首次提供将R-loop失调与银屑病联系起来的证据。研究人员构建了一个R-loop相关诊断特征，并鉴定SRPK1为银屑病发病机制的潜在关键驱动因子。结合体外研究结果，这些结果表明SRPK1可能既是有前景的诊断生物标志物，也是银屑病的潜在治疗靶点。
一、研究背景与科学问题
银屑病是慢性、免疫介导的炎症性皮肤病，由角质形成细胞（keratinocyte, KC）与免疫细胞之间复杂互作驱动，核心涉及TNF-α/IL-23/IL-17轴失调，进而促进表皮过度增殖、KC异常分化和持续炎症。虽然治疗已从传统系统药物转向靶向生物制剂和小分子抑制剂，且抗TNF-α、IL-17、IL-23生物制剂显著改善临床结局，但停药后复发率高，长期缓解仍是临床挑战。皮肤组织常驻记忆T细胞（resident memory T cells, TRM）和具有炎症记忆的KC被认为与复发相关。同时，炎性皮肤病变表型重叠或合并药疹时，可靠分子生物标志物具有补充价值。
R-loop是由RNA-DNA杂交链和游离单链DNA组成的三链核酸结构，参与基因表达调控、DNA复制和表观遗传修饰。R-loop过度积累可诱导DNA双链断裂和基因组不稳定，并通过cGAS-STING、NF-κB等信号通路激活固有免疫、促进炎症因子释放。R-loop失调已与癌症及炎症性疾病相关，如肺腺癌、UV诱导皮肤损伤和炎症性肠病中DHX9缺失。银屑病具有炎症驱动的细胞过度增殖、DNA复制应激和基因组不稳定等特征，但R-loop在银屑病中的作用此前未被研究。因此，研究人员开展本研究，旨在探索R-loop相关基因在银屑病病理生理中的作用，构建诊断特征并鉴定关键分子驱动因子。
二、关键技术方法概述
研究人员整合GEO来源的五个批量RNA队列（GSE30999，n=170；GSE41664，n=157；GSE13355，n=116；GSE14905，n=58；GSE6710，n=26）和一个scRNA-seq数据集（GSE173706，含11例perilesional和14例psoriatic plaque皮肤样本）。从R-loopBase获取1185个人R-loop相关基因。以limma鉴定差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），与R-loop相关基因取交集。训练集为GSE30999和GSE41664，外部验证集为GSE13355、GSE6710和GSE14905，使用ComBat校正批次。采用Elastic Net逻辑回归构建RRDS，SHAP解释模型，单样本基因集富集分析（Single-Sample Gene Set Enrichment Analysis, ssGSEA）计算R-loop评分。scRNA-seq采用Seurat/Harmony聚类、UMAP可视化和Slingshot拟时序分析。HaCaT细胞中通过siRNA敲低SRPK1，并用qRT-PCR和CCK-8验证。
三、研究结果
银屑病皮损较非皮损显示升高的R-loop活性。在五个独立队列中，ssGSEA显示皮损（LS）较非皮损（NL）R-loop活性升高。火山图展示各队列DEGs，五个队列共识获得758个上调DEGs和762个下调DEGs；与R-loop相关基因取交集后得到R-loop相关DEGs用于后续分析。
功能分析揭示从细胞黏附向增殖的协调转变。蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络显示，上调网络围绕细胞周期和DNA复制，涉及CDC45、MCMs和GINSs等；下调网络涉及细胞黏附、细胞骨架稳定和蛋白稳态。基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）分析显示，上调基因富集于细胞周期进展、DNA复制和有丝分裂，下调基因富集于细胞-基质黏附、黏着斑信号和细胞外基质组织。
构建RRDS并鉴定SRPK1为关键驱动因子。研究人员分别整合训练队列和外部验证队列，并用ComBat校正批次，主成分分析确认批次差异被有效去除。Elastic Net逻辑回归通过10折交叉验证选择最优λ，最终从R-loop相关DEGs中定义八基因RRDS：SRPK1、BLM、SAMD9、TPX2、KIF23、APOBEC3B、CDCA8和MKI67。这些基因存在显著共表达关系。SRPK1对LS与NL分类的贡献最大，模型在训练集和外部验证集中均表现出优秀分类性能。
RRDS的诊断性能与临床效用。八基因RiskScore在训练队列和外部验证队列中均取得高受试者工作特征（Receiver Operating Characteristic, ROC）曲线下面积（Area Under the Curve, AUC）；单个基因预测能力不一，联合特征更稳健。校准曲线显示预测概率与实际观察银屑病病例高度一致。决策曲线分析（Decision Curve Analysis, DCA）表明，在广泛风险阈值范围内，RiskScore较“全部”或“无”策略提供更高净获益。SHAP分析进一步显示，SRPK1平均绝对SHAP值最高，其高表达持续对应正SHAP值，推动预测为银屑病阳性；依赖图和个体force plot支持SRPK1为该诊断模型关键驱动基因。
银屑病皮肤单细胞图谱将KC定位为SRPK1上调主要来源。scRNA-seq无监督聚类和UMAP识别出8种细胞类型，包括KC、成纤维细胞、平滑肌细胞、黑素细胞、内皮细胞、T细胞、髓系细胞和神经细胞。SRPK1表达主要定位于KC簇，且在银屑病斑块（PP）KC中较perilesional（PN）KC显著升高。
SRPK1富集于病理分化轨迹相关的特定KC亚簇。对KC再聚类获得KC_1至KC_8八个亚群，SRPK1在KC_4亚群中独特富集，且KC_4中PP较PN显著升高。拟时序轨迹分析将高表达SRPK1的KC_4置于病理KC分化轨迹关键分支点，分隔基底/增殖状态与终末异常分化状态。GO富集显示KC_4独特富集细胞呼吸和细胞能量代谢相关条目，如氧化磷酸化和质子动力驱动ATP合成。该结果将SRPK1置于银屑病KC致病轨迹的关键细胞命运决定点。
SRPK1敲低减轻体外角质形成细胞过度增殖。免疫荧光显示SRPK1在HaCaT细胞质和细胞核中广泛表达，并与微管网络共定位。siRNA敲低后，qRT-PCR确认KD组SRPK1 mRNA水平较NC组降低（P < 0.001）。CCK-8增殖实验显示，SRPK1沉默后HaCaT细胞在96小时内增殖率显著受损（P < 0.001）。这些体外结果与单细胞和机器学习预测一致，提示SRPK1直接促进KC增殖，从而推动银屑病进展。
四、讨论总结
讨论指出，银屑病治疗已转向靶向生物制剂和小分子药物，但复发仍是主要挑战，这与TNF-α/IL-23/IL-17轴、TRM和KC炎症记忆有关。本研究首次报告银屑病皮损中R-loop活性升高，并建立和验证八基因RRDS，SHAP识别SRPK1为核心贡献基因；单细胞分析将SRPK1定位至处于关键分化节点的致病性KC_4亚群，体外实验进一步验证SRPK1敲低抑制KC增殖。研究优势在于整合批量转录组建模与单细胞验证，使RRDS在多队列中稳健识别病变相关R-loop特征，并通过scRNA-seq提供细胞背景证据。
讨论还比较了R-loop在癌症中的意义：肺腺癌中高R-loop评分与较差总生存相关并涉及细胞周期调控；黑色素瘤中高R-loop评分通过免疫逃逸和代谢重编程驱动进展；骨肉瘤中高R-loop评分因DNA损伤增加与不良预后相关。银屑病以过度增殖和炎症为特征，研究人员认为相关高转录活性可能导致R-loop积累；R-loop失调引起的DNA损伤和基因组不稳定可能成为与银屑病DNA损伤特征相连的机制桥梁。活性氧（reactive oxygen species, ROS）升高触发氧化性DNA损伤，促进核DNA片段释放至胞质，激活cGAS-STING固有免疫通路并触发TNF-α分泌。因此，靶向R-loop介导的DNA损伤可能是减轻银屑病炎症的新策略。
关于SRPK1，讨论指出其可磷酸化富含丝氨酸-精氨酸结构域蛋白，尤其是SR蛋白家族，从而通过引导其入核调控mRNA可变剪接（alternative splicing, AS）；核内SRPK1还调控早期剪接体组装。SRPK1在多种癌症中促进进展，并与NF-κB、PI3K/AKT等信号通路相关；在炎症疾病中，SRPK1上调可放大促炎细胞因子表达并通过AKT通路促进细胞增殖。在KC中，SRPK1可促进HPV16感染。本研究中，KC_4处于分化轨迹主要分支点，SRPK1在该阶段上调，提示其可能作为该决定点的调控因子，推动KC走向致病谱系；基于其调控可变剪接的功能，SRPK1可能调节R-loop动态关键基因的加工，稳定致病性R-loop，促进KC过度增殖和促炎表型。体外实验证实SRPK1敲低抑制HaCaT增殖，与单细胞和机器学习结果一致。
局限性包括：RRDS主要基于转录组生物信息分析，建立的是相关性而非因果性；未进一步研究下游分子机制如PI3K/AKT，也未在SRPK1操作后直接评估R-loop水平；研究基于公共数据库，批次效应和混杂因素不能完全排除；HaCaT为永生化细胞系，不能完全再现原代KC体内生理特征，且缺乏大规模人临床标本和动物模型验证。未来研究方向包括：在细胞水平定量检测异常SRPK1表达后R-loop积累，阐明下游信号机制；收集银屑病患者临床标本并进行多组学分析，建立标本库，在咪喹莫特诱导小鼠等动物模型中验证SRPK1功能及抑制SRPK1的治疗潜力；在扩大临床队列中验证诊断模型，并分析皮损中SRPK1蛋白丰度与银屑病临床严重程度评分的相关性。
五、研究结论翻译
本研究对银屑病中R-loop失调进行了综合分析，将全局病理现象与特定分子驱动因子联系起来。研究人员首先确立银屑病皮损以R-loop活性显著升高为特征。在此基础上，研究人员开发并严格验证了一种新的八基因RRDS，其在多个队列中区分银屑病皮肤与健康皮肤方面表现出卓越准确性。关键是，通过将机器学习与先进可解释性方法整合，研究人员将SRPK1确定为该特征中的关键基因。单细胞分析进一步将SRPK1功能定位到关键分化检查点的特定致病性KC亚群（KC_4），将其作用直接与疾病的细胞病理联系起来。此外，体外功能实验提供直接生物学证据，表明SRPK1在人角质形成细胞中稳健表达，且其敲低显著抑制角质形成细胞增殖，从而验证了计算预测，并确认SRPK1是银屑病发病机制核心的过度增殖表型的功能驱动因子。总体而言，这些发现不仅为银屑病提供了诊断工具，还将SRPK1确定为高潜力治疗靶点。这项工作强调了R-loop调控在银屑病发病机制中的关键作用，并为这一复杂炎症性疾病提供了潜在靶点。
