《Frontiers in Immunology》：An optimized spectral flow cytometry pipeline for longitudinal blood leukocyte immunophenotyping reveals stable, individually distinct immune signatures
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引言：外周血白细胞免疫表型分型提供了一种微创了解个体免疫系统的途径，是检测和监测疾病的有吸引力的生物标志物。高参数光谱流式细胞术（spectral flow cytometry）的进步现在以前所未有的细节解析白细胞亚群，但这种深度增加了样本制备、采集和分析的复
引言：外周血白细胞免疫表型分型提供了一种微创了解个体免疫系统的途径，是检测和监测疾病的有吸引力的生物标志物。高参数光谱流式细胞术（spectral flow cytometry）的进步现在以前所未有的细节解析白细胞亚群，但这种深度增加了样本制备、采集和分析的复杂性，引入了可能掩盖纵向监测所需生物学信号的技术变异性。方法：研究人员构建并验证了一个优化的、高参数光谱流式细胞术流程，用于重复性血液白细胞分析，并探究由此产生的特征是否足够稳定且独特，足以随时间推移识别个体。结果：使用彩虹校准微球（rainbow beads）和单克隆抗体（monoclonal-antibody）光谱，研究人员确认仪器性能和光谱拆分（spectral unmixing）在超过两年内保持稳定，并且这种双重测量将故障定位到仪器或试剂。针对一个稳定的生物学不变对照，基于降维方法PaCMAP的门控策略在操作者间的可重复性显著高于传统的二维门控，并产生了更纯净的群体。化学固定和一周的抗体预储存保留了白细胞组成，而延迟处理和更严重的冷冻保存则改变了它，后者通过近乎完全的中性粒细胞丢失实现。在所测试的计数归一化方案中，归一化至CD45+白细胞百分比最能随时间保留个体特征，而计数微球归一化表现最差。将该流程应用于一年内反复采样的十名捐献者，研究人员发现白细胞特征主要由人与人之间稳定、个体独特的差异所主导——这种差异如此显著，以至于一个留出的访视样本可以通过训练好的随机森林（random forest）以及简单地通过接近该捐献者自身均值的方式被重新分配回其捐献者。结论：这些结果共同定义了一个技术上可靠、操作者可重复且处理稳健的流程，其归一化后的特征捕获了时间上稳定的个体免疫指纹，为血液白细胞谱分析作为癌症及其他疾病免疫状态的纵向生物标志物提供了实用基础。
研究背景与科学问题
外周血作为一种易于获取的微创样本，其白细胞组成携带着反映健康状态、疾病进程和治疗应答的信息，因此非常适合用于纵向监测和发现癌症等疾病的细胞生物标志物。高参数光谱流式细胞术能够通过读取每个探针的全发射光谱而非单一通道，分离发射峰相近但整体光谱不同的染料，从而在一次检测中解析数十个白细胞亚群，极大增强了免疫表型分析的深度。然而，这种复杂性也引入了从样本制备、数据采集到分析等多个环节的技术变异，可能掩盖真正反映生物学变化的信号。具体而言，仪器性能漂移、光谱拆分参考的不稳定性、人工圈门的主观性、样本前处理（如延迟处理、冷冻保存、化学固定）对细胞组成的改变，以及不同批次间计数归一化策略的不一致，都是纵向研究中需要解决的关键技术挑战。因此，本研究的核心目标是建立一个经过系统优化和验证的高参数光谱流式细胞术分析流程，并检验在这种严格控制下，个体的血液白细胞特征是否足够稳定且具有区分度，从而可作为有意义的纵向生物标志物。
研究方法概述
本研究采用了一套多维度优化的实验与分析流程。首先，研究人员利用彩虹校准微球和单染抗体的全光谱特征，建立了一种双重质量控制指标，持续追踪仪器性能和试剂完整性。其次，在门控策略上，比较了基于PaCMAP降维方法的门控与传统二维双参数门控在不同操作者之间的可重复性和门控纯度。再次，系统评估了四种常见的前处理变量（冷藏延迟、冷冻保存、化学固定、抗体预存）对外周血白细胞组成的影响。最后，通过比较多种计数归一化方案（包括基于总CD45+白细胞百分比、计数微球和采集体积的归一化，以及在此基础上加入CD-CHEX稳定对照进行跨批次校正的两级方案），结合随机森林和最近质心分类器对来自10名健康捐献者、为期约一年的纵向样本进行供体再识别验证，来确定最优的数据处理路径。
研究结果
互补的质量控制措施确认仪器和光谱拆分稳定性并区分仪器与试剂故障
通过追踪38个采集日期（跨度约32个月）的两种独立质量控制指标，研究发现大部分时间点仪器性能和抗体光谱特征高度稳定。两个异常日期分别揭示了不同的故障模式：一个表现为仪器级别的故障（彩虹微球和抗体光谱同时偏离），另一个则为特定串联染料（PE-Fire 810）降解导致的试剂故障，证明了双重测量体系在快速定位问题源方面的有效性。
PaCMAP门控比传统二维双参数门控更能可重复地鉴定白细胞亚群
三位经验丰富的操作者对固定化生物对照样本（CD-CHEX）进行了独立门控。结果显示，两种方法在时间稳定性上相当，但基于PaCMAP的门控在操作者间的一致性（组内相关系数ICC为0.969）显著优于传统二维门控（ICC为0.742）。此外，PaCMAP门控产生的污染率更低（0.22%对比0.37%），产生无污染门控的频率更高（79.8%对比63.4%）。由于PaCMAP无法清晰界定精细亚群，研究人员最终采用了先由PaCMAP划分主要谱系、再由传统二维门控细分亚群的混合策略。
最小化纵向免疫表型分析中的前处理和分析间变异
研究人员发现，冷藏延迟处理（2-3天）会因中性粒细胞选择性丢失而显著改变白细胞组成；冷冻保存（无论使用CryoStor还是DMSO）导致中性粒细胞和嗜酸性粒细胞几乎完全丧失，引起淋巴细胞相对比例大幅上升。相比之下，化学固定（固定后第1天和第5天）和抗体预存一周均未对主要谱系组成产生显著影响。鉴于化学固定可能扭曲精细亚群，研究人员默认采用新鲜细胞分析，辅以稳定的预制抗体混合物。
%CD45归一化改善纵向稳定性，而计数微球归一化降低稳定性
在两种独立数据集（独立的CD-CHEX批次和10位捐献者的重复新鲜样本）中，基于CD45+百分比（%CD45）的归一化方案在两个层级上均表现出比原始计数更优的时间稳定性。相比之下，基于体积的归一化和一级计数微球归一化与原始计数无显著差异，而二级计数微球归一化甚至显著降低了稳定性，表明计数微球归一化引入了而非消除了纵向变异性。
随机森林再识别证实%CD45归一化和亚群特征最佳保留个体供体特征
利用机器学习对10位捐献者进行供体再识别（随机森林，留一次访视交叉验证，随机概率0.10）。所有方案的准确率都远超随机水平，其中%CD45方案表现最高（亚群特征集下，一级和二级归一化准确率分别为0.960和0.956）。贝叶斯对比模型显示，虽然%CD45倾向于优于原始计数，但未达到统计学上的可信差异；然而，计数微球归一化方案显著劣于其他方案。此外，包含精细亚群的特征集比仅含主要谱系的特征集提供了更多的个体鉴别信息，准确率提升约0.22。最近质心分类器的结果与随机森林高度一致，进一步证实了个体白细胞特征的直接可恢复性。
血液白细胞特征由稳定、个体独特的供体间差异主导
方差分解分析（PERMANOVA）表明，供体身份解释了白细胞组成总方差的75%，而采样时间点仅解释了15%。尽管时间效应在统计上显著，但供体差异的影响是其五倍。置换检验显示，供体间的离散度是供体内离散度的1.9倍。主坐标分析可视化进一步表明，每位捐献者的多次访视样本聚集在特征空间中独特的、基本不重叠的区域，而按时间点分组则严重重叠。驱动这种分离的细胞群体横跨固有免疫（中性粒细胞、NK细胞）和适应性免疫（CD4+T细胞）两大分支。
总结与讨论
本研究成功构建并验证了一个用于纵向血液白细胞免疫表型分析的光谱流式细胞术优化流程。该流程整合了稳定的仪器质量控制、高操作者间可重复性的PaCMAP门控策略、恰当的前处理方法以及有效的%CD45归一化方案。核心生物学发现是，在严格控制技术变异后，个体的血液白细胞组成构成一种时间上稳定且个体间高度区分的“免疫指纹”。这种指纹的稳定性使得仅凭简单的相似性度量就能将单次访视样本准确地归回其供体。这一发现对于将血液免疫特征用作疾病（如癌症）生物标志物具有重要意义，因为疾病相关的变化很可能需要通过偏离个体自身基线的方式来检测，而非依赖人群参照。研究同时指出，计数微球归一化会引入额外噪声，应谨慎使用；而如需量化绝对细胞数量的变化，基于体积的归一化（配合CD-CHEX跨批次校正）是一个合理的补充选择。
