《Frontiers in Neurology》：Ferroptosis-associated candidate genes in aneurysmal subarachnoid hemorrhage: evidence from human peripheral blood and mouse brain
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背景：动脉瘤性蛛网膜下腔出血（aneurysmal subarachnoid hemorrhage, aSAH）具有高发病率和高死亡率。铁死亡（ferroptosis）可能参与aSAH相关脑损伤，但其外周血和脑内相关特征仍不明确。
方法：研究人员使用limm
背景：动脉瘤性蛛网膜下腔出血（aneurysmal subarachnoid hemorrhage, aSAH）具有高发病率和高死亡率。铁死亡（ferroptosis）可能参与aSAH相关脑损伤，但其外周血和脑内相关特征仍不明确。
方法：研究人员使用limma分析人外周血数据集GSE36791（43例aSAH，18例对照），并进行FerrDb交集、加权基因共表达网络分析（weighted correlation network analysis, WGCNA）、基因本体（Gene Ontology, GO）/京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析和基于蛋白-蛋白相互作用（protein–protein interaction, PPI）的优先级排序。对10例aSAH患者和10例非SAH对照的外周血进行实时定量PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）验证；aSAH样本在破裂后24 h内采集。平均年龄分别为60.2 ± 7.7岁和63.6 ± 8.9岁，男性分别为5例和4例。脑水平验证使用GSE79416小鼠皮层和OMIX006611小鼠SAH单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据。雄性C57BL/6 J小鼠（8周，20–22 g）接受小脑延髓池自体血注射；SAH后1天收集脑组织（n = 6/组）。还进行了免疫浸润和分子对接。
结果：在2,645个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）中，35个与铁死亡相关。MAPK3、STAT3、G6PD和PGD被优先列为铁死亡相关候选基因，并在人aSAH外周血、小鼠SAH皮层和临床qPCR队列中上调。单细胞分析显示相应小鼠基因在注释的脑细胞类型中表达，尤其是在免疫/胶质细胞群中。在小鼠SAH脑组织中，MAPK3/ERK1、STAT3、PGD和G6PD蛋白水平升高，p-STAT3/STAT3比值升高，丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量增加，谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）活性降低。免疫谱显示中性粒细胞、肥大细胞和活化树突状细胞增加。Ganoderic acid A被优先列为初步in silico候选物。
结论：MAPK3、STAT3、G6PD和PGD是aSAH中铁死亡相关候选基因，得到人外周血、小鼠皮层、单细胞和小鼠脑验证支持。Ganoderic acid A仍为探索性in silico候选物，需要进一步功能验证。
动脉瘤性蛛网膜下腔出血（aneurysmal subarachnoid hemorrhage, aSAH）是颅内动脉瘤破裂所致的高致死、高致残卒中亚型。aSAH后72 h内可出现血脑屏障破坏、脑水肿等早期脑损伤（early brain injury, EBI）。铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖性调节性细胞死亡，特征是细胞内铁潴留、谷胱甘肽降低和脂质活性氧堆积。蛛网膜下腔出血后铁离子快速增加，参与Fenton反应并产生ROS；含多不饱和脂肪酸的膜磷脂在脂氧合酶（lipoxygenase, LOX）作用下氧化为脂质氢过氧化物，最终导致细胞铁死亡。但aSAH中铁死亡的外周血和脑内特征仍不清楚。因此研究人员结合人外周血、小鼠皮层、单细胞和小鼠脑验证，寻找铁死亡相关候选基因。
研究人员分析人外周血GSE36791（43例aSAH，18例对照），与FerrDb交集，采用limma、WGCNA、GO/KEGG、PPI；qPCR验证临床队列（10例aSAH，10例非SAH；aSAH破裂后24 h内采集；平均年龄60.2 ± 7.7和63.6 ± 8.9岁，男性5和4例；2023年7—10月天津医科大学总医院神经外科）。脑验证用GSE79416小鼠皮层和OMIX006611单细胞RNA-seq；雄性C57BL/6 J小鼠（8周，20–22 g）经小脑延髓池自体血注射，SAH后1天取材（n = 6/组）。另做免疫浸润、GSEA、Western blotting、免疫荧光、MDA和GPX4活性及分子对接。
数据标准化与DEGs分析。研究人员对GSE36791进行limma标准化，PCA显示样本重复一致性较好；在18例对照和43例aSAH外周血中筛选DEGs，以|FC| > 1.2且p < 0.05为阈值，发现1,097个上调基因和1,548个下调基因，共2,645个DEGs，并展示火山图和热图。
WGCNA与关键模块识别。研究人员对中位绝对偏差最大的5,000个基因构建WGCNA网络，选择软阈值β = 8，得到30个模块。与aSAH正相关最高的为cyan和dark green模块（相关系数0.59和0.48），负相关最高的为green和turquoise模块（相关系数?0.64和?0.52），提示这些模块基因与aSAH高度相关。
Ferr-DEGs验证与富集分析。Venn图显示GSE36791中198个基因与FerrDb重叠，其中35个为铁死亡相关差异表达基因（ferroptosis-related differentially expressed genes, Ferr-DEGs）。与健康对照相比，ACSL4、FTH1、STAT3和MAPK3等促铁死亡驱动因子广泛上调，而部分抗氧化或抑制性FRGs相对下调。GO富集主要涉及应激反应、代谢稳态、自噬相关组分、氧化还原酶活性和营养代谢；KEGG富集于铁死亡、脂质与动脉粥样硬化、氨基酸生物合成通路。原文指出这些通路可能反映一般氧化和炎症反应，而非aSAH独有。
aSAH与对照免疫浸润差异。研究人员用CIBERSORT和ssGSEA分析外周血免疫浸润，CIBERSORT显示aSAH组中性粒细胞、活化肥大细胞和活化树突状细胞水平较高；ssGSEA呈相似趋势；Spearman相关分析显示Ferr-DEGs与ssGSEA免疫细胞评分相关。原文提示这些免疫变化也可能代表急性损伤或应激的一般系统反应。
Ferr-DEGs枢纽基因识别。研究人员将Ferr-DEGs上传STRING构建PPI网络，经Cytoscape和cytoHubba识别10个枢纽基因：PGD、FTH1、SLC40A1、STAT3、TXNRD1、ACSL4、MAPK3、G6PD、NFE2L2、SAT1。MCODE识别3个密集簇，评分分别为4.286、4.000和3.000。将PPI枢纽基因与WGCNA四个相关模块基因取交集，得到STAT3、G6PD、MAPK3和PGD四个枢纽基因。进一步分析缺血性卒中和创伤性脑损伤外周血数据集，四个基因也均显著上调，提示其并非aSAH独有，而可能是急性脑血管损伤共享的外周应激、炎症和代谢反应。
关键枢纽基因表达与GSEA分析。研究人员对前4个枢纽基因进行单基因GSEA，以p < 0.05筛选，KEGG通路富集主要集中于核糖体。
aSAH中铁死亡相关枢纽基因验证。在GSE36791人外周血数据集中，STAT3、MAPK3、G6PD和PGD在aSAH样本中高于对照；Benjamini–Hochberg FDR校正后仍显著上调：PGD校正p = 9.96 × 10
?5，G6PD校正p = 0.00957，MAPK3校正p = 0.01284，STAT3校正p = 0.01831。在GSE79416小鼠皮层数据集中，对应小鼠同源基因Mapk3、Stat3、G6pdx和Pgd在SAH皮层中显著上调。临床外周血qPCR进一步确认aSAH患者MAPK3、STAT3、PGD和G6PD表达升高。OMIX006611小鼠SAH单细胞RNA-seq显示Mapk3、Stat3、G6pdx和Pgd可在注释脑细胞类型中检测到，尤其在免疫/胶质细胞群中表达较明显。这些结果为四个枢纽基因提供外周血、小鼠皮层和单细胞水平的跨数据集支持。
SAH小鼠脑内枢纽基因蛋白表达和铁死亡相关生化改变验证。研究人员在SAH小鼠模型中检测蛋白表达。Western blotting显示SAH小鼠皮层裂解液中总STAT3、PGD、G6PD和MAPK3/ERK1蛋白水平显著高于假手术对照；p-STAT3/STAT3比值升高，提示STAT3信号激活。SAH小鼠MDA水平显著增加，GPX4活性降低，提示脂质过氧化增强和GPX4依赖的抗氧化防御受损。免疫荧光染色进一步确认SAH脑组织中STAT3、G6PD、PGD和MAPK3阳性信号增加。原文强调这些数据支持铁死亡相关生化改变，而非铁死亡细胞死亡的确定性证明。
小分子优先级和分子对接分析。研究人员以四个铁死亡相关DEGs为治疗靶点，从比较毒理基因组学数据库（Comparative Toxicogenomics Database, CTD）检索小分子，进行Venn分析，优先选出灵芝酸A（Ganoderic acid A, GAA）作为潜在多靶点候选物，预测其与PGD、MAPK3、G6PD和STAT3相互作用。分子对接结合自由能分别为PGD ?9.0 kcal mol
?1、MAPK3 ?8.8 kcal mol
?1、G6PD ?7.6 kcal mol
?1、STAT3 ?7.5 kcal mol
?1。原文指出GAA对PGD和MAPK3结合尤其有利，但仅属初步in silico候选，需进一步功能验证。
讨论指出，铁死亡与aSAH后EBI密切相关，及时检测和抑制铁死亡对预后重要。研究从GSE36791获得2,645个DEGs，其中35个与FerrDb重叠，GO/KEGG显示与氧化应激和铁死亡相关；WGCNA和PPI识别STAT3、G6PD、MAPK3和PGD。研究人员进一步比较缺血性卒中和创伤性脑损伤数据集，发现四个基因也上调，因此它们并非aSAH特异，可能代表急性神经损伤共享的外周应激、炎症和代谢反应。由于发现数据来自外周血，研究人员又分析小鼠皮层和单细胞数据，显示对应小鼠同源基因在SAH皮层上调，并在免疫/胶质细胞群中可检测，但原文指出这不能证明外周血表达直接反映脑表达。
讨论中对四个基因的功能进行总结：STAT3是细胞质转录因子，受炎症细胞因子或生长因子激活后入核调节DNA转录，参与分化、增殖、抗凋亡、炎症和血管生成，并可加剧炎症诱导的铁死亡，导致aSAH不良预后；Yamamoto et al.报道rapamycin可作为激活STAT3治疗aSAH后EBI的新型药理策略。MAPK3属于MAPK家族，参与增殖、炎症和细胞代谢，与ERK通路激活、神经分化和增殖相关，但其激活aSAH铁死亡的具体机制尚不清楚。G6PD是戊糖磷酸途径（pentose phosphate pathway, PPP）关键酶，G6PD缺乏可减缓HCC细胞铁转化并抑制肿瘤进展；Luo等报道G6PD上调与aSAH后神经元保护相关，G6PD升高与神经元损伤减少同步，可能与抗氧化防御和DNA修复有关。PGD也参与能量代谢和PPP，Dubreuil发现PGD敲低破坏PPP并抑制ROS堆积，但其与aSAH和铁死亡的关系仍需研究。四个枢纽基因均与延迟性脑缺血（delayed cerebral ischemia, DCI）相关基因集重叠，可能通过铁稳态破坏、ACSL4驱动的脂质过氧化放大、GPX4/SLC7A11介导的抗氧化崩溃以及STAT3/MAPK3依赖的炎症和血管反应通路协同作用，促进微血管痉挛、微血栓和血脑屏障破坏，驱动SAH后3—14天DCI发生和进展。但原文也强调这些基因参与多种应激和炎症通路，可能并非aSAH铁死亡特异。
讨论还总结aSAH免疫反应时间线：急性期（≤72 h）先天免疫激活、小胶质细胞活化、中性粒细胞和单核/巨噬细胞募集，IL-6、TNF-α、IL-10升高；亚急性期（3—14天）炎症变化与血管痉挛和DCI风险相关；恢复期（≥14天）炎症逐渐减轻，但可能残留脑积水和免疫功能障碍。中性粒细胞在急性期占主导，释放ROS、蛋白酶和中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps, NETs），加重血脑屏障破坏、神经炎症和微血栓。单核细胞早期增加并迁移入脑分化为巨噬细胞，吞噬红细胞分解产物，同时释放IL-6、TNF-α和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs），加重脑损伤和血管痉挛；亚急性期向抗炎M2表型转变，参与修复。CIBERSORT和ssGSEA显示aSAH患者外周血活化中性粒细胞、活化树突状细胞、单核细胞和肥大细胞较高，支持铁-炎症轴作为潜在治疗靶点。但外周血指标不能完全代表脑内免疫微环境，需脑脊液和脑组织研究。
小鼠验证支持四个枢纽基因的生物学相关性：Western blotting和免疫荧光确认SAH小鼠脑组织MAPK3/ERK1、STAT3、PGD和G6PD蛋白增加；MDA升高和GPX4活性降低提示铁死亡相关氧化脂质损伤。原文指出这些是铁死亡相关生化改变证据，而非铁死亡细胞死亡的确证，因为未进行铁死亡抑制剂或基因特异性干预的救援实验。分子对接优先选出GAA，其他神经损伤或铁死亡相关模型提示GAA可能具有抗氧化和抗铁死亡特性，但本研究未在aSAH模型中实验测试GAA，因此对接结果仅作为初步化合物优先级排序，不代表治疗疗效、直接结合、靶点参与或临床转化潜力。
局限性包括：主要发现数据集来自外周血，不同数据集未在同个体或同物种配对；四个枢纽基因是细胞应激、炎症和代谢的多效性传感器，其上调不太可能仅特异于铁死亡或aSAH，需要基因特异性功能缺失和获得研究确定因果；免疫细胞浸润仅从外周血推断，可能不能忠实反映动脉瘤破裂后颅内免疫环境；MDA和GPX4活性支持铁死亡相关生化改变，但确定性证明铁死亡细胞死亡需要救援实验；GAA在aSAH中的疗效和安全性尚未探索，需专门的药代动力学和药效学研究。
研究结论翻译：研究人员确定MAPK3、STAT3、G6PD和PGD为aSAH中关键铁死亡相关枢纽基因。这些基因可能构成aSAH中铁死亡活性的可靠生物标志物，而Ganoderic acid A显示出具有机制基础的治疗潜力，可减轻aSAH相关铁死亡，从而为临床干预引入新途径。
