AKNA作为预后生物标志物通过STING激活与巨噬细胞重编程抑制子宫内膜癌进展

《Frontiers in Immunology》：AKNA serves as a prognostic biomarker and restrains endometrial cancer progression via STING activation and macrophage reprogramming

背景：AKNA是一种AT-hook转录因子，在癌症发生中发挥关键作用。然而，其在子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）中的预后价值和生物学功能仍不清楚。方法：为系统研究AKNA在EC中的作用，研究人员整合了多组学数据[癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）、基因型-组织表达（Genotype-Tissue Expression，GTEx）和单细胞转录组学]、双独立临床队列[TCGA-UCEC数据集和两个机构队列]以及体外/体内实验模型。采用免疫组织化学、逆转录定量PCR（RT-qPCR）和Western blotting进行表达验证。进行功能实验，包括慢病毒介导的AKNA敲低/过表达、CCK-8、划痕愈合、Transwell、流式细胞术和集落形成实验，以评估AKNA调节对增殖、迁移、侵袭、上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、化疗敏感性和巨噬细胞极化的影响。机制上，采用染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）测序（ChIP-seq）、ChIP-qPCR和双荧光素酶报告基因实验来确定AKNA对干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）的转录调控。开发了一个整合AKNA表达与临床病理特征的预后列线图，并在独立队列中进行外部验证。结果：与正常子宫内膜相比，AKNA在EC组织中显著下调，这与国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）晚期、侵袭性组织学亚型和不良预后相关。AKNA敲低促进EC细胞增殖、迁移、侵袭和EMT，同时增强M2巨噬细胞极化并降低对紫杉醇的敏感性，并可能损害抗肿瘤固有免疫。相反，AKNA过表达或通过环鸟苷酸-腺苷酸（cyclic GMP–AMP，cGAMP）激活STING可逆转这些恶性表型。机制上，AKNA直接结合STING启动子并转录激活STING，从而诱导TANK结合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK1）和干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）磷酸化。将AKNA与临床病理特征结合的列线图在预测EC复发方面表现出高准确性，并在训练和验证队列中优于单变量模型。结论：AKNA缺陷通过转录抑制STING和驱动M2巨噬细胞极化促进EC进展。AKNA可作为稳健的预后生物标志物以及化疗和固有免疫调节的预测指标，为EC精准治疗提供有前景的治疗靶点。

研究背景：子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）是发达国家最常见的妇科恶性肿瘤，近几十年来发病率显著上升。2022年全球癌症统计报告显示，每年约420,242例新发和97,704例死亡。多数患者诊断时处于早期，预后较好；然而约15%患者表现为晚期疾病。五年总生存（overall survival，OS）率随分期显著变化，FIGO（International Federation of Gynecology and Obstetrics，国际妇产科联盟）III期为40-65%，IV期仅15-17%。晚期或复发EC的治疗选择仍有限。免疫治疗惠及部分患者，但检查点抑制剂的客观缓解率总体有限。因此，需要新型生物标志物改善预后分层并指导EC治疗决策。AKNA是AT-hook转录因子家族成员，参与转录调控、免疫反应和癌症发病机制。已有证据显示AKNA在多种恶性肿瘤中起关键作用：宫颈癌中AKNA单核苷酸多态性与癌症易感性相关，人乳头瘤病毒E6下调AKNA表达以促进肿瘤进展；上皮性卵巢癌中AKNA遗传变异增加易感性；Camargo et al.证明AKNA在神经发生中调节EMT；胃癌中AKNA作为肿瘤抑制因子，可能通过调节EMT相关信号通路发挥作用。综上，这些发现支持AKNA的肿瘤抑制作用，靶向AKNA可能是有前景的策略。然而，AKNA在EC中的预后意义和分子机制仍不清楚。本研究旨在探索AKNA在EC中的预后意义和功能作用。研究结果表明，AKNA既是预后指标也是肿瘤抑制因子。通过激活STING（stimulator of interferon genes，干扰素基因刺激因子）通路，AKNA促进巨噬细胞向抗肿瘤表型极化，从而抑制肿瘤进展。此外，研究人员建立了整合AKNA表达与临床病理特征的列线图，可识别高风险EC患者并促进个体化治疗决策。

主要关键技术方法：研究人员整合多组学数据，包括TCGA-UCEC（The Cancer Genome Atlas Uterine Corpus Endometrial Carcinoma）队列、GTEx v8正常对照、单细胞转录组及蛋白表达数据；使用两个机构队列，训练队列为FAHCQMU（First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University）395例，验证队列为WCHCQMU（Women and Children’s Hospital of Chongqing Medical University）285例，并收集20对新鲜EC与癌旁正常子宫内膜组织。采用免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）、RT-qPCR和Western blotting验证表达；通过慢病毒介导AKNA敲低/过表达，结合CCK-8、划痕愈合、Transwell、流式细胞术和集落形成实验评估表型；采用ChIP-seq、ChIP-qPCR和双荧光素酶报告基因实验研究转录调控；构建皮下小鼠模型；建立并验证预后列线图。

研究结果：
3.1 AKNA下调与EC不良预后相关。通过TCGA泛癌分析，研究人员发现AKNA在多种实体瘤中表达显著降低，尤其在EC。EC中AKNA表达随组织学分级升高和FIGO分期进展而降低，在拷贝数高亚型中最低。蛋白谱证实EC中AKNA低于正常子宫内膜，机构队列IHC验证该结果。20对匹配肿瘤-正常组织通过IHC、RT-qPCR和Western blotting证实mRNA和蛋白水平一致下调。TCGA-UCEC中低AKNA与晚期FIGO、高分级、侵袭性组织学亚型和TP53突变相关；机构队列中与年龄较大、晚期FIGO、淋巴血管间隙浸润（lymphovascular space invasion，LVSI）、异常p53表达和接受辅助治疗相关。生存分析显示，高AKNA预示TCGA-UCEC和机构队列中无复发生存期（recurrence-free survival，RFS）和OS更佳。
3.2 AKNA抑制EC细胞恶性表型。研究人员通过慢病毒转导在Ishikawa和HEC-1A建立稳定AKNA敲低和过表达细胞。Western blotting显示，沉默AKNA增强Ki-67表达并促进EMT，表现为N-cadherin和vimentin上调、E-cadherin下调；AKNA过表达抑制这些改变。CCK-8显示AKNA下调增强增殖，上调减弱增殖。划痕愈合中AKNA沉默加速间隙闭合，过表达延迟。Transwell显示沉默促进迁移和侵袭，过表达抑制。结论为AKNA抑制EC细胞增殖、迁移和EMT。
3.3 AKNA表达与EC微环境巨噬细胞极化相关。ESTIMATE算法分析显示，高AKNA EC样本的stromal、immune和ESTIMATE评分显著升高，肿瘤纯度降低，符合免疫富集微环境。MCP-counter显示AKNA表达与T细胞、髓系树突细胞、单核细胞、巨噬细胞和单核细胞正相关。单细胞图谱显示AKNA在髓系区室（单核细胞、巨噬细胞和树突细胞）优先富集，也在淋巴亚群和成纤维细胞富集。基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）显示高AKNA组免疫通路显著激活，包括免疫浸润、固有免疫及巨噬细胞激活、分化、增殖和迁移。TCGA扩展分析确认AKNA与肿瘤浸润淋巴细胞标志物、主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）II类分子和共刺激分子正相关。功能实验证实，AKNA敲低EC细胞条件培养基促进巨噬细胞向M2样极化，CD86⁺ M1样比例降低，CD206⁺ M2样比例升高；AKNA过表达培养基升高CD86⁺ M1并降低CD206⁺ M2比例。
3.4 AKNA通过cGAS-STING通路介导巨噬细胞极化。GeneMANIA预测AKNA与ITGAL、CD38和LAX1等免疫效应分子相互作用，与TCGA-UCEC中免疫相关基因正相关一致。Gene Ontology（GO）/Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）分析确认AKNA共表达基因富集于免疫炎症过程，尤其固有免疫、胞质DNA感知和JAK-STAT信号。研究人员检测该通路，发现AKNA敲低降低TANK结合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK1）、干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）和STING磷酸化，减少STING蛋白丰度而不影响总TBK1和IRF3水平；过表达增强这些蛋白磷酸化并选择性增加STING丰度。STING过表达或环鸟苷酸-腺苷酸（cyclic GMP–AMP，cGAMP）处理恢复AKNA敲低细胞中TBK1和IRF3磷酸化。条件培养基从AKNA敲低EC细胞使巨噬细胞向免疫抑制性CD206⁺ M2表型极化，该转变可被STING过表达或cGAMP刺激逆转。酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）显示，AKNA敲低显著降低干扰素-β（interferon-β，IFN-β）和CXCL10分泌，过表达升高；CCL5分泌各组相近，CXCL9和CXCL11持续低于定量下限。AKNA ChIP-seq在STING转录起始位点观察到明显结合峰，与A/T富集调控簇共定位；ChIP-qPCR证实抗Flag IP组STING启动子显著富集；双荧光素酶报告基因实验显示，突变STING启动子中A/T富集元件消除AKNA介导的转录激活。皮下Ishikawa异种移植中，AKNA敲低组肿瘤体积和生长速率显著增加，STING过表达部分挽救该表型。IHC显示AKNA敲低肿瘤STING表达降低、CD86⁺细胞浸润减少、CD206⁺积聚增加，STING过表达部分挽救。肿瘤内AKNA与STING水平和CD86⁺细胞密度正相关，与CD206⁺密度负相关。395例临床EC标本分析显示，AKNA降低与STING蛋白水平降低、CD86⁺细胞密度降低和CD206⁺细胞积聚增加相关，相关分析确认正/负相关。
3.5 免疫治疗反应生物信息预测和化疗敏感性验证。利用癌症药物敏感性基因组学（Genomics of Drug Sensitivity in Cancer，GDSC）数据库，高AKNA表达与紫杉醇和多西他赛敏感性增加显著相关。肿瘤免疫功能障碍和排斥（Tumor Immune Dysfunction and Exclusion，TIDE）算法分析显示，高AKNA EC中预测免疫治疗反应者比例较低AKNA高11.3%（42.9%对31.6%，P=0.065）。基于该预测，高AKNA EC可能对免疫治疗反应更好。集落减少率分析显示，紫杉醇（3.2 ng/mL）或顺铂（10 μg/mL）处理后，shAKNA EC细胞集落减少率显著低于shNC，表明AKNA耗竭降低这些浓度下的化疗敏感性；AKNA过表达增加集落减少率，增强化疗敏感性。cGAMP处理显著提高shNC细胞集落减少率，并部分恢复shAKNA细胞化疗敏感性。体内shAKNA异种移植模型中，与vehicle组相比，紫杉醇+卡铂（paclitaxel plus carboplatin，TP）单药部分抑制肿瘤生长，延迟进展并降低终末肿瘤体积和重量；cGAMP联合TP比TP单药产生显著更强肿瘤抑制，表明药理激活STING与TP化疗协同。
3.6 建立包含AKNA和临床病理因素的复发预测模型。FAHCQMU队列395例为训练集，WCHCQMU队列285例为验证集，两组基线临床病理参数可比。多变量分析确认AKNA为EC复发独立预测因子，高AKNA表达显著延长RFS并具保护效应（HR=0.363，95%CI：0.207-0.643，P<0.001）；FIGO分期、组织学亚型、LVSI、p53状态和肌层浸润深度也显著。整合AKNA表达和临床病理特征的联合模型预测性能优于单变量模型，训练队列曲线下面积（area under the curve，AUC）为0.880，优于AKNA单独0.659和临床病理因素单独0.779；验证队列AUC分别为0.872、0.655和0.748。六变量列线图中AKNA贡献显著预后价值，列线图在内部和外部验证中1、3、5年校准良好。决策曲线分析（decision curve analysis，DCA）显示，列线图对1年RFS净获益可忽略，但在3年和5年RFS广泛阈值概率范围内净获益为正且优于临床病理参数单独和AKNA单独。以受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）分析约登指数最大化的最佳风险阈值0.810，患者分为低风险（>0.810）和高风险（≤0.810），低风险患者训练和验证队列RFS和OS显著延长。

讨论总结：应用免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）受肿瘤异质性限制，仅部分患者获益，可靠免疫治疗靶点亟待确定。本研究表明，AKNA在EC组织较匹配正常子宫内膜显著降低，低AKNA患者预后显著更差，提示AKNA可能作为EC潜在独立预后生物标志物。功能验证显示，AKNA敲低增强EC细胞增殖、迁移和侵袭，支持其肿瘤抑制作用，并与胃癌、宫颈癌中的抗肿瘤作用一致，支持AKNA为泛癌肿瘤抑制因子。AKNA与头颈鳞状细胞癌和肺腺癌免疫相关过程有关；既往研究确立AKNA为T细胞激活的关键主调控因子。本研究分析EC免疫微环境，发现AKNA表达与巨噬细胞浸润、stromal评分和immune评分正相关；GSEA显示高AKNA组巨噬细胞相关功能通路富集；功能验证显示AKNA敲低促进M2巨噬细胞极化，提示AKNA缺陷可能通过调节巨噬细胞极化促进EC进展。研究人员进一步证明，AKNA通过激活cGAS-STING通路抑制M2巨噬细胞极化，促进固有抗肿瘤免疫。cGAS-STING通路调节包括巨噬细胞和T细胞在内的免疫细胞激活、浸润和表型转换。既往研究多关注cGAS构象变化激活cGAS-STING，而本研究验证AKNA可在转录水平直接激活STING；HDAC3、HIF-1、NF-κB和STAT1等转录因子也可直接结合STING启动子上调其表达，与本研究一致。讨论提出“转录priming”模型：癌细胞存在基因组不稳定和微核产生内源性cGAS配体；在生理STING水平下，这些阈下DNA信号不能触发强下游激活；AKNA转录上调STING扩大STING蛋白池，降低激活阈值，使基础DNA损伤信号有效转化为TBK1/IRF3磷酸化。该模型与AKNA过表达单独增强p-STING、p-TBK1和p-IRF3而无需外源DNA刺激一致，也符合染色体不稳定和内源性DNA损伤慢性参与癌细胞cGAS-STING轴。条件培养基转移设计保持巨噬细胞内在AKNA恒定，隔离肿瘤细胞自主效应；髓系AKNA相对贡献是未来方向。分泌组分析显示，AKNA-STING轴选择性促进EC细胞IFN-β和CXCL10分泌，CCL5不变，CXCL9和CXCL11低于定量下限。这种选择性诱导与经典STING-TBK1-IRF3信号级联一致，其中活化IRF3优先驱动I型干扰素和干扰素刺激基因转录。IFN-β和CXCL10是促进M1巨噬细胞募集和活化的已知介质；AKNA敲低后二者分泌减少，为共培养系统中M2偏斜极化提供机制解释。尽管ICIs和TP联合化疗是EC重要策略，但客观缓解率不佳和获得性耐药限制疗效。基于预测算法模型，研究提示高AKNA表达可能与EC患者对ICIs更优治疗反应相关。AKNA缺陷降低特定浓度下紫杉醇和顺铂化疗敏感性，cGAMP部分挽救；shAKNA异种移植中cGAMP联合TP显著强于TP单药，提示药理STING激活可减轻AKNA缺陷驱动的体内化疗耐药。体外化疗敏感性数据来自单剂量集落形成实验，未来需多浓度剂量反应分析。研究还开发整合AKNA表达与临床病理参数的预后列线图，实现个体化复发风险评估和风险分层；DCA显示1年RFS净获益小，可能因EC早期事件率低，而3年和5年列线图净获益显著。列线图在训练和验证队列一致。局限包括：完整趋化因子网络和旁分泌介质未完全表征；AKNA复发预测模型需大规模多中心前瞻性验证；裸鼠模型缺乏成熟T细胞，限制适应性免疫和免疫检查点抑制剂直接评估，未来需免疫活性同基因模型。

研究结论翻译：本研究确定AKNA为与EC恶性进展和不良临床结局相关的独立预后生物标志物。机制上，AKNA直接结合STING启动子中A/T富集元件激活TBK1/IRF3信号，cGAMP恢复该轴可逆转体外和体内恶性表型。临床上，AKNA作为独立预后生物标志物，其整合入列线图可实现准确复发预测，为调节固有免疫和增强EC化疗敏感性提供有前景的治疗靶点。