《Frontiers in Immunology》：A MYC-LDHA-MCT4 expression program marks an SPP1/TREM2-centered macrophage state in pancreatic ductal adenocarcinoma
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摘要专业翻译：
引言： 胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）对免疫检查点阻断疗法反应不佳，其髓系屏障的代谢组织机制尚未被完全阐明。
方法： 研究人员整合了来自II期临床试验NCT04177810的成像质谱
摘要专业翻译：
引言： 胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）对免疫检查点阻断疗法反应不佳，其髓系屏障的代谢组织机制尚未被完全阐明。
方法： 研究人员整合了来自II期临床试验NCT04177810的成像质谱流式细胞术（imaging mass cytometry, IMC）数据、三个单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq）数据集、两个空间转录组队列（共12个组织切片）、三个生存分析队列，并结合体外siRNA干扰实验，分别沉默MYC、LDHA和SLC16A3基因，利用条件培养基实验对THP-1来源的巨噬细胞样细胞及原代人CD8+ T细胞进行处理与分析。
结果： CD8+ T细胞浸润增加，但未观察到客观缓解，同时巨噬细胞仍保持丰富。患者水平的上皮MYC及糖酵解程序与SLC16A3（MCT4）及巨噬细胞乳酸接收程序相关。在12个空间切片中，巨噬细胞接收者评分在MCT4高表达核心周围更高（环1：12/12为阳性；中位差异0.433；FDR = 0.010），其中SPP1/TREM2巨噬细胞的状态特异性信号最强（中位差异0.613；FDR = 0.006）；经组成校正后的效应仍为阳性（10/12），但未达到统计学显著（FDR = 0.071）。沉默MYC、LDHA或SLC16A3可降低细胞外乳酸水平并改变条件培养基效应，而乳酸回补可部分挽救该效应。生存关联呈队列依赖性，且存在显著异质性。
讨论： 上述结果定义了一种基于表达水平的探索性空间关联，即肿瘤MYC-LDHA-MCT4程序与SPP1/TREM2为中心的巨噬细胞状态之间的关联，构成一个可检验的假说，而非乳酸转运的直接证据。
论文解读文章：
一、研究背景与问题提出
胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）是致死率最高的实体肿瘤之一，其特点是早期播散、致密纤维间质增生以及对免疫治疗的高度抵抗。尽管PD-1或CTLA-4阻断在部分癌种中可产生持久缓解，但未经选择的PDAC患者通常无响应。其免疫微环境以成纤维细胞和髓系细胞程序为主导，限制效应T细胞的进入与功能。一项近期II期临床试验将CXCR4拮抗剂与抗PD-1联合用于PDAC治疗，结果显示T细胞被招募进入肿瘤病灶，但未产生客观缓解，同时伴随免疫抑制性巨噬细胞持续存在。这一临床现象提示，当代谢适应的髓系屏障持续存在时，单纯免疫招募并不足以产生疗效。
代谢重编程被认为是该屏障的重要组织者。MYC协调葡萄糖摄取与糖酵解，LDHA将丙酮酸转化为乳酸，质子偶联转运体MCT4（由SLC16A3编码）负责将乳酸从高糖酵解细胞中输出。细胞外乳酸与酸中毒可抑制细胞毒性淋巴细胞、改变树突状细胞功能，并促进与血管生成、基质重塑和免疫调节相关的巨噬细胞状态。然而，转录本丰度并不等同于乳酸通量，大多数基于bulk肿瘤的研究无法确定哪些细胞产生或接收代谢信号，也无法确定这些细胞的空间位置。SPP1和TREM2表达的巨噬细胞状态已在PDAC及其他治疗抵抗性肿瘤中被描述，但其功能因组织与疾病背景而异。基于此，研究人员提出一个核心问题：肿瘤上皮的MYC-LDHA-MCT4乳酸输出程序是否在空间上与SPP1/TREM2为中心的巨噬细胞接收状态相关联。
二、研究内容与主要结论
研究人员整合了II期临床试验NCT04177810的成像质谱流式细胞术（imaging mass cytometry, IMC）数据、GSE154778和GSE155698两个单细胞RNA测序数据集、GSE217845肿瘤-血液配对样本、GSE274103（5个切片）与GSE235315（7个切片）两个独立Visium空间转录组队列，以及TCGA-PAAD、GSE62452和GSE71729三个生存队列。体外实验中，研究人员在PANC-1和MIA PaCa-2细胞中沉默MYC、LDHA和SLC16A3，收集条件培养基处理THP-1来源的巨噬细胞样细胞与原代人CD8+ T细胞，并设置乳酸回补及pH/渗透压匹配对照。
研究得出以下主要结论：第一，在CXCR4抑制剂联合抗PD-1的临床试验中，21例患者均未获得客观缓解，但11例配对IMC标本中9例CD8+ T细胞比例增加（中位配对变化0.0069；FDR = 0.035），巨噬细胞比例在9/11例中同样增加（中位变化0.0766；FDR = 0.112）。第二，在GSE154778中，上皮糖酵解程序与SLC16A3（MCT4）表达呈正相关（Spearman ρ = 0.80，P = 1.81×10-4），MYC活性与MCT4亦呈正相关（ρ = 0.73，P = 0.00125）；在GSE217845中，上皮MYC及MCT4/输出评分与SPP1/TREM2巨噬细胞的乳酸接收程序显著相关（ρ = 0.81，FDR = 0.016；ρ = 0.82，FDR = 0.015）。第三，空间分析显示，在12个切片中，MCT4高表达恶性核心周围的巨噬细胞接收者评分在最近邻环（环1）中全部为阳性（12/12；中位差异0.433；FDR = 0.010），其中SPP1/TREM2巨噬细胞信号最强（12/12阳性；中位差异0.613；FDR = 0.006）；经上皮丰度、髓系丰度及文库大小校正后，调整效应在10/12个切片中仍为阳性，但FDR = 0.071，未达统计学显著。第四，体外实验中，沉默MYC、LDHA或SLC16A3均降低细胞外乳酸水平，条件培养基处理降低了巨噬细胞SPP1、TREM2、GPNMB、APOE、SLC16A1/MCT1、LDHB和MRC1表达，乳酸回补可部分恢复该效应，而pH/渗透压对照无此作用；巨噬细胞乳酸摄取在敲低条件培养基暴露后下降，乳酸回补后上升；对照组条件培养基处理的巨噬细胞降低了CD8+ T细胞增殖和IFN-γ释放，而敲低组条件培养基的这一抑制作用减弱，乳酸回补可部分恢复。第五，生存分析显示，TCGA-PAAD中连续联合评分与总生存期相关（HR per SD 1.64，95% CI 1.24-2.17；P = 5.26×10-4），GSE62452亦呈正相关（HR 1.47，95% CI 1.04-2.08；P = 0.031），但GSE71729未重复该方向（HR 0.88，95% CI 0.71-1.09；P = 0.237），三队列固定效应汇总HR为1.17（95% CI 1.00-1.36；P = 0.048），但异质性极高（I2 = 85.9%），随机效应估计不显著（HR 1.27，95% CI 0.83-1.94）。
三、关键技术方法概述
研究采用的主要技术方法包括：成像质谱流式细胞术（IMC）用于II期临床试验配对组织分析；单细胞RNA测序数据分析（Seurat 5.5.1流程，Harmony批次校正，scDblFinder双细胞去除，SingleR参考注释）；基于染色体窗口表达评分的恶性上皮候选细胞鉴定；Visium空间转录组分析（以切片内标准化上皮、乳酸产生、乳酸输出和SLC16A3表达组件构建未调整MCT4/输出核心评分，按四分位数定义高/低区域，以最近邻环1-3定义空间邻域，采用配对Wilcoxon符号秩检验进行切片水平推断）；参考映射（Seurat FindTransferAnchors）用于状态解析；体外siRNA沉默MYC、LDHA和SLC16A3结合条件培养基实验；乳酸酶学检测；THP-1巨噬细胞样细胞与原代人CD8+ T细胞共培养功能实验；连续Cox比例风险模型及固定/随机效应meta分析用于生存关联评估。样本队列来源包括：临床试验NCT04177810、GSE154778、GSE155698、GSE217845、GSE274103、GSE235315、TCGA-PAAD、GSE62452和GSE71729。
四、研究结果分述
3.1 CD8 T细胞招募发生但无客观缓解且巨噬细胞持续丰富
在CXCR4抑制剂/抗PD-1试验中，21例患者均未获得客观缓解。11例配对IMC标本中，CD8+ T细胞比例在9/11例中增加（FDR = 0.035），巨噬细胞比例在9/11例中增加但未通过多重校正（FDR = 0.112）。在独立配对肿瘤与外周血样本中，SPP1/TREM2和MRC1/CD163巨噬细胞在肿瘤中均高于血液（名义P = 0.036；FDR = 0.060）。
3.2 患者水平分析将MYC和糖酵解与MCT4及巨噬细胞接收程序关联
在GSE154778中，糖酵解与MCT4（ρ = 0.80，P = 1.81×10-4）及MYC活性与MCT4（ρ = 0.73，P = 0.00125）显著正相关。在GSE217845中，上皮MYC和MCT4/输出评分与SPP1/TREM2巨噬细胞乳酸接收程序显著相关（FDR分别为0.016和0.015）。恶性候选细胞在两个单细胞队列中均具有相对较高的乳酸输出评分。
3.3 MYC和LDHA支持肿瘤内在恶性表型
在PANC-1细胞中，siRNA沉默MYC或LDHA降低其表达，并减少增殖、克隆形成、迁移和侵袭。人类蛋白质图谱免疫组化显示两种蛋白在肿瘤组织中表达。
3.4 MCT4高表达恶性区域与可复制的巨噬细胞接收模式相关
在5个GSE274103和7个GSE235315空间样本中，巨噬细胞接收者评分在MCT4高表达核心周围的最内环中12/12为阳性（中位差异0.433；FDR = 0.010），外环仍保持阳性。CAF接收者效应异质性较大，CD8效应细胞排斥信号未独立复制。
3.5 SPP1/TREM2程序显示最强的巨噬细胞状态关联
状态解析空间分析显示，SPP1/TREM2巨噬细胞是最一致的接收者群体（环1：12/12阳性；中位差异0.613；FDR = 0.006）。SPP1、GPNMB、SLC16A1、LGALS3、VEGFA、CXCL8和CTSB在MCT4高表达核心附近反复富集。沿FCN1至SPP1/TREM2连续体，GPNMB、APOE、TREM2、SPP1、LDHB和SLC16A1增加，而S100A8/S100A9减少。患者感知的伪bulk分析提示氧化磷酸化、胆固醇稳态和MYC相关程序富集。
3.6 组成校正敏感性分析
在校正上皮丰度、髓系丰度和文库大小后，环1调整后的SPP1/TREM2接收者效应在10/12个切片中保持阳性，中位调整差异为0.103，名义Wilcoxon P = 0.017，但经完整目标-环家族Benjamini-Hochberg校正后FDR = 0.071，未达统计学显著。队列分层分析方向异质且统计效能不足。
3.7 肿瘤乳酸输出扰动在体外改变条件培养基效应
沉默MYC、LDHA或SLC16A3在PANC-1和MIA PaCa-2细胞中降低细胞外乳酸，对葡萄糖和pH影响相对较小。敲低降低肿瘤细胞活力，乳酸回补部分挽救SLC16A3敲低表型。敲低条件培养基降低巨噬细胞SPP1、TREM2、GPNMB、APOE、SLC16A1/MCT1、LDHB和MRC1表达，乳酸回补部分恢复，pH/渗透压对照无效应。巨噬细胞乳酸摄取在敲低条件培养基下降低，乳酸回补后增加。对照组条件培养基降低CD8+ T细胞增殖和IFN-γ，敲低组条件培养基此效应减弱，乳酸回补部分恢复。
3.8 生存关联在不同独立队列间存在差异
TCGA-PAAD（177例，93个OS事件）中连续联合评分与OS相关（HR per SD 1.64，95% CI 1.24-2.17；P = 5.26×10-4），校正后仍显著（HR 1.55，95% CI 1.16-2.06；P = 0.00295）。GSE62452（65例，49个事件）HR为1.47（95% CI 1.04-2.08；P = 0.031）。GSE71729（123例，83个事件）未复制方向（HR 0.88，95% CI 0.71-1.09；P = 0.237）。三队列固定效应HR为1.17（95% CI 1.00-1.36；P = 0.048），I2 = 85.9%，随机效应不显著（HR 1.27，95% CI 0.83-1.94）。
3.9 探索性免疫和基质分析显示较弱或不一致的关联
树突状细胞和Treg程序、NETosis/中性粒细胞、CAF状态和施万细胞程序的探索性分析均未发现与巨噬细胞接收者信号同等强度或一致复制的效应，提示该空间关联对SPP1/TREM2巨噬细胞接收者程序具有特异性。
五、讨论总结与研究结论
讨论部分指出，跨数据集观察到的上皮MYC-LDHA-MCT4表达程序与SPP1/TREM2巨噬细胞程序在PDAC中的共定位构成一种基于表达水平、可检验的空间关联假说，而非已证实的乳酸梯度或代谢微环境。转录本丰度不等于代谢物浓度或通量，Visium斑点含多种细胞，转运体丰度不能指定净转运方向，因此“乳酸输出”和“生态位”仅为转录替代指标。II期CXCR4试验数据提供临床动机而非机制证据，CD8+ T细胞招募与功能可能是可分离的特征。SPP1/TREM2巨噬细胞在MCT4高表达区域附近表现出最大的径向差异并表达GPNMB、SLC16A1、LDHB及脂质和氧化代谢程序，但转运体表达和通路富集均不能直接测量乳酸摄取。体外扰动实验提供功能背景，但MYC和LDHA扰动广泛影响糖酵解通量、NAD+/NADH平衡和增殖，SLC16A3扰动可改变质子偶联代谢物转运，乳酸回补仅部分挽救，提示乳酸是多种改变的条件培养基组分之一。THP-1细胞系与原发性肿瘤相关巨噬细胞存在表观遗传和代谢可塑性差异，二维条件培养基实验无法再现三维基质屏障、缺氧和酸性梯度。生存分析显示评分可移植性受限，GSE71729的反向结果界定了该评分作为预后模型的重要边界。未来研究应测试评分与KRAS等位基因状态、TP53/CDKN2A/SMAD4改变及经典/基底样亚型的关系，并建议在免疫活性KPC衍生模型中结合肿瘤细胞选择性Mct4缺失或药理学MCT4抑制与抗PD-1治疗进行机制验证。
研究结论： 本研究在PDAC中鉴定了一种重复出现的空间和转录关系，即上皮MYC-LDHA-MCT4程序与SPP1/TREM2巨噬细胞状态之间的关联。体外扰动和部分回补结果与乳酸贡献相容，但不能证明其因果作用。该模型是一个可检验的肿瘤-髓系代谢相互作用框架，而非已证实的因果通路或经过验证的预后工具。
