《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Gut microbiota disturbance disrupts osteonal organization and mechanical competence during postnatal cortical bone maturation in rabbits with local metabolic and transcriptional remodeling
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引言： 骨强度不仅取决于骨量和骨矿密度（BMD），还取决于皮质组织结构和材料质量。骨单位（osteon）是皮质骨的关键结构单元，然而肠道菌群紊乱是否在骨单位水平影响皮质骨成熟仍不清楚。
方法： 研究人员首先表征了1、2、3月龄新西兰兔的皮质管重塑及骨单位组织情
引言： 骨强度不仅取决于骨量和骨矿密度（BMD），还取决于皮质组织结构和材料质量。骨单位（osteon）是皮质骨的关键结构单元，然而肠道菌群紊乱是否在骨单位水平影响皮质骨成熟仍不清楚。
方法： 研究人员首先表征了1、2、3月龄新西兰兔的皮质管重塑及骨单位组织情况。随后在该早期骨单位形成窗口期内施加抗生素诱导的菌群紊乱（AIMD），并评估肠道菌群组成、骨单位形态、皮质骨micro-CT参数、力学性能、股骨代谢组学及皮质骨转录组学。
结果： AIMD降低了肠道菌群多样性并改变了菌落结构。在3月龄时，AIMD处理的兔子表现出骨单位组织受损，包括次级骨单位比例降低及骨单位形态改变。这些骨单位水平的变化伴随着最大载荷和刚度的下降，而常规micro-CT参数（皮质几何结构和矿化密度）保持不变。多组学分析进一步揭示了涉及脂质相关代谢物、骨基质调控、骨细胞通讯及代谢酶程序的局部代谢和转录重塑。
讨论： 这些发现提示，早期肠道菌群紊乱会损害骨单位水平的皮质骨成熟并降低力学性能。骨单位组织可能代表了出生后骨骼发育过程中受肠道菌群紊乱影响的皮质骨质量的一个敏感层面。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
骨强度不仅取决于骨量和骨矿密度（BMD），还取决于皮质组织的结构和材料质量。长期以来，BMD和骨小梁微结构被广泛用于评估骨骼健康，但皮质骨是长骨力学性能的主要决定因素。在皮质骨内部，骨单位和皮质内管道系统构成了参与组织重塑、基质组织、血管整合和承载的关键结构单元。骨单位水平的组织因此代表了皮质骨质量的一个重要但常被忽视的维度。
骨单位组织在出生后皮质骨成熟过程中逐步建立。在这一过程中，皮质内血管管道被整合为初级骨单位，而次级骨单位结构则随持续重塑而出现。兔子是研究这一过程的理想模型，因为其长骨发育出显著的皮质内管道和骨单位系统，而小鼠的生理性皮质内重塑有限，通常缺乏明显的次级骨单位系统。然而，骨单位组织建立的早期发育窗口期，以及该过程对系统性环境扰动的敏感性，此前尚未被充分界定。
肠道菌群已成为骨骼发育和骨稳态的重要调控者，可通过免疫、内分泌和代谢途径发挥作用。无菌动物实验表明，肠道菌群的存在与否可显著影响骨量和破骨细胞相关免疫活性。抗生素诱导的肠道菌群扰动已被证明可破坏骨免疫通讯并改变骨发育和重塑。然而，既往关于肠道菌群–骨骼轴的研究多聚焦于BMD、骨小梁微结构、血清骨转换标志物或一般重塑指标。当涉及皮质骨时，通常仅使用粗粒度micro-CT参数（如皮质厚度、面积和矿化密度）进行评估。在多个菌群相关干预模型中，检测到骨小梁变化但未伴随皮质指标的相应改变。然而，皮质几何结构和矿化密度保持不变并不能证明皮质成熟未受影响，因为这些指标无法直接捕捉皮质内管道和骨单位的组织情况。因此，肠道菌群紊乱是否在皮质骨成熟过程中破坏骨单位组织，此前尚属未知。
二、研究目的与设计
本研究旨在：（1）表征新西兰兔出生后早期皮质骨发育过程，以确定皮质内管道重塑和骨单位组织的窗口期；（2）在该窗口期内用抗生素诱导肠道菌群紊乱（AIMD），并评估肠道菌群组成、骨单位形态、皮质骨micro-CT参数、力学性能、股骨皮质骨代谢组学和皮质骨转录组学；（3）确定早期肠道菌群紊乱是否破坏皮质成熟过程中的骨单位组织，并表征伴随的局部代谢和转录变化。
三、关键技术方法
研究人员使用了以下主要技术方法：
（1）硬组织树脂包埋与切片：股骨样本经4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脱水、甲基丙烯酸甲酯树脂包埋后，使用硬组织切片机切取10 μm未脱钙切片。
（2）甲苯胺蓝染色与组织学成像：树脂切片经脱塑、复水后行甲苯胺蓝染色，用于骨单位形态分析。在股骨横截面上预设背侧、腹侧、内侧和外侧四个皮质感兴趣区（ROI），计算血管管道密度及骨单位面积等形态参数。
（3）Micro-CT分析：使用NMC-200系统在80 kV、0.06 mA条件下扫描股骨样本，以51 μm各向同性体素重建图像，定量分析皮质厚度、皮质面积和组织矿化密度。
（4）三点弯曲力学测试：使用Shimadzu AGX-S系统，支撑跨距14 mm，加载速率2 mm/min，测定最大载荷和刚度。
（5）16S rRNA基因测序：对粪便样本V3-V4区进行扩增子测序，经DADA2流程生成扩增子序列变体（ASV），评估菌群α多样性和β多样性。
（6）非靶向代谢组学：基于液相色谱–串联质谱（LC-MS/MS），对股骨皮质组织进行代谢物检测和鉴定。
（7）RNA测序（RNA-seq）：提取皮质骨总RNA，构建文库后在Illumina NovaSeq X Plus平台测序，比对至家兔参考基因组OryCun2.0，使用DESeq2进行差异表达分析。
（8）逆转录定量PCR（RT-qPCR）：验证骨发育信号、破骨细胞相关基因、细胞外基质（ECM）/骨基质基因、骨细胞通讯/间隙连接基因和代谢酶基因的表达。
（9）转录组-代谢组整合分析：计算差异表达基因（DEG）与差异代谢物之间的Pearson相关系数，构建KEGG/KGML支持的基因-代谢物-通路网络。
样本来源：雄性新西兰白兔，饲养于北京通和立泰生物科技有限公司，所有动物实验经该公司伦理委员会批准。发育窗口期分析使用1、2、3月龄兔子；AIMD实验从1月龄开始干预至3月龄收集样本，骨形态计量和力学测试每组5只动物，配对多组学分析每组3只动物。
四、研究结果
（一）兔子出生后早期皮质骨发育过程中骨单位组织的渐进性建立
研究人员对1、2、3月龄新西兰兔股骨皮质骨进行了组织学观察和定量分析。在股骨横截面上预设四个皮质感兴趣区（ROI）以减少单视野选择偏倚。代表性组织学图像显示，1月龄皮质以丰富的血管管道为主，虽可见部分管道周围未成熟基质沉积，但不符合典型骨单位或哈弗斯系统的标准，因此被归类为血管管道而非骨单位。2月龄时，初级骨单位变得明显；3月龄时，以中央哈弗斯管、同心板层和可识别的外周黏合线为特征的次级骨单位在部分皮质区域出现。定量分析显示，血管管道密度从1月龄到2月龄增加（P = 0.0407），3月龄保持相似水平。骨单位面积从2月龄到3月龄在四个皮质区域均显著增加（背侧P = 8.14 × 10-4，腹侧P = 2.78 × 10-4，内侧P = 0.0191，外侧P = 0.0030）。这些发现表明，1–3月龄区间涵盖了骨单位形成的起始和早期进展，从1月龄富含血管管道的不成熟皮质过渡到2、3月龄明显的初级和新兴次级骨单位结构，因此该区间被称为早期骨单位形成窗口期。
（二）AIMD在早期骨单位形成窗口期内诱导肠道菌群紊乱
研究人员从1月龄开始对兔子施用含利福昔明（80 mg/kg）、新霉素（100 mg/kg）和甲硝唑（30 mg/kg）的抗生素混合物，持续至3月龄。16S rRNA基因测序显示，AIMD显著降低了肠道菌群α多样性：Shannon指数降低（P = 0.0151），观察到的ASV数（P = 0.0106）和Chao1丰富度指数（P = 0.0233）均降低。β多样性分析显示，对照组和AIMD组在Bray-Curtis主坐标分析（PCoA）空间中呈现分离趋势，表明AIMD改变了肠道菌群的整体群落结构。属水平组成分析显示两组呈现不同的优势菌群模式。线性判别分析效应大小（LEfSe）分析鉴定了若干组相关菌属，包括对照组富集的阿克曼菌属（Akkermansia）和梭菌UCG-014，以及AIMD组富集的UCG-010。差异菌属热图显示，拟杆菌属（Bacteroides）在AIMD组相对富集，而双歧杆菌属（Bifidobacterium）、罗斯氏菌属（Roseburia）、另枝菌属（Alistipes）和厌氧棍状菌属（Anaerostipes）在对照组相对富集。
（三）AIMD改变骨单位形态并损害皮质骨力学性能
组织学观察显示，对照组兔皮质骨含有有序的骨单位结构，包括初级骨单位和新兴次级骨单位；而AIMD处理兔呈现较不规则的骨单位结构，表现为次级骨单位减少和骨单位形态规则性降低。这种改变并非局限于单一皮质采样区域。定量分析显示，AIMD组次级骨单位比例低于对照组（P = 0.0112），表明向更成熟的次级骨单位组织的进展受损。形态学参数分析显示，AIMD与初级和次级骨单位面积减小相关（初级骨单位面积P = 0.00113，次级骨单位面积P = 0.00223），骨单位圆度降低（初级骨单位圆度P = 0.00695）。Micro-CT分析显示，两组在皮质厚度、皮质面积和组织矿化密度方面无显著差异，表明常规micro-CT测量未捕捉到AIMD相关的整体皮质几何结构或矿化变化。然而，三点弯曲测试显示，AIMD组最大载荷（P = 0.0167）和刚度（P = 0.0313）均显著低于对照组，表明皮质骨力学性能受损。常规micro-CT参数不变与力学行为受损之间的分离提示，骨单位微结构和常规micro-CT未捕捉的其他组织-材料特性可能对观察到的力学表型有贡献。
（四）AIMD与以脂质相关代谢物为主的股骨代谢组重塑相关
非靶向代谢组学分析显示，主成分分析（PCA）显示对照组和AIMD组样本部分分离，表明AIMD与整体股骨代谢组谱的转变相关。差异代谢物分析鉴定了一组在AIMD处理兔中升高或降低的代谢物。差异代谢物的分类显示，这些变化涉及多种化学和代谢类别，其中脂质和脂质样分子、有机酸及其衍生物、氨基酸相关代谢物和其他小分子贡献显著。进一步的代谢类型分类表明，脂质/脂肪酸相关代谢物代表了AIMD相关代谢变化的主要组成部分，且大多数脂质相关差异代谢物在AIMD组中降低。代表性差异代谢物中，PGF1α（前列腺素相关脂质介质）和脱氧皮质酮（DOC，类固醇激素相关代谢物）在AIMD处理样本中均降低（PGF1α P = 0.0071，DOC P = 0.0327），表明AIMD相关的股骨代谢变化涉及脂质介质相关和类固醇相关代谢特征。
（五）AIMD伴随早期骨单位组织过程中的皮质骨转录组重塑
RNA-seq分析显示，PCA显示对照组和AIMD样本部分分离，表明AIMD与整体皮质骨转录组谱的转变相关。所有DEG的分层聚类将AIMD样本与对照样本分离，并揭示了与组别相关的不同表达模式。火山图式差异表达分析鉴定了一组在AIMD处理兔中上调或下调的基因。RT-qPCR验证了五个功能模块的代表性基因：成骨/骨发育信号、破骨细胞相关基因、ECM/骨基质、骨细胞通讯/间隙连接和代谢酶，结果显示这些模块存在与组别相关的表达模式。KEGG富集分析显示，上调DEG涉及细胞骨架组织、钙信号、收缩性相关过程和能量代谢相关通路；下调DEG与免疫/炎症反应、间隙连接和细胞-细胞通讯、钙黏蛋白信号、谷胱甘肽代谢和外源物/药物代谢相关过程相关。这些富集模式表明，AIMD诱导了广泛的皮质骨转录组重塑，而非单一孤立通路的改变。
（六）整合转录组-代谢组分析识别AIMD后的分子关联
研究人员对前100个具注释基因符号的DEG与所有差异代谢物进行了Pearson相关分析。相关热图显示差异基因与代谢物之间存在正相关和负相关关联。进一步构建了KEGG/KGML支持的基因-代谢物-通路网络，突出了涉及代谢调控、代谢物转运和类固醇相关代谢特征的若干连接基因-代谢物模块。代表性连接包括CPT1B与L-肉碱，以及DOC相关的与转录调控因子和代谢基因的连接。整合分析表明，AIMD相关的骨单位改变伴随着皮质骨的转录组和代谢组变化。
五、讨论与结论
本研究的发现表明，早期肠道菌群紊乱与骨单位水平的皮质骨成熟受损和力学性能降低相关，并伴随局部分子环境的重塑。该研究的价值在于将肠道菌群–骨骼轴的研究框架延伸至皮质骨单位组织水平。既往研究常用BMD、骨小梁参数、骨转换标志物或整体骨力学性能来评估菌群相关骨骼效应，而本研究通过聚焦初级和次级骨单位结构，揭示了常规micro-CT测量无法捕捉的皮质骨质量变化维度。
常规micro-CT参数与力学性能之间的分离具有重要信息价值。皮质骨强度不仅取决于骨大小和矿物质含量，还取决于皮质微结构和局部材料特性。在骨单位水平，板层组织、骨单位边界和组织水平力学异质性有助于抗裂性和皮质韧性。因此，观察到的骨单位组织改变是力学性能降低的一个合理解释因素。AIMD后最大载荷和刚度的降低可能反映了皮质组织质量受损，而非简单的皮质骨量丢失。
代谢组学发现提供了骨单位水平变化的分子背景。AIMD与股骨皮质骨代谢谱的转变相关，多个差异代谢物涉及脂质介导或类固醇相关代谢。PGF1α反映前列腺素相关脂质介质，DOC与类固醇激素代谢相关。脂质及其生物活性衍生物（包括前列腺素）可调节骨细胞活性、炎症信号和组织重塑。转录组学发现进一步支持AIMD后的局部分子重塑：ECM组织相关基因可能影响基质沉积和组织结构，间隙连接和骨细胞通讯程序的改变可能影响皮质网络内骨细胞的协调，代谢酶基因的变化则表明与骨单位组织相关的细胞程序发生了协调重塑。
研究人员提出一个探索性概念模型：AIMD诱导的肠道菌群紊乱伴随发育中皮质骨的局部代谢和转录重塑，可能有助于骨单位组织受损和力学性能降低。该模型假设菌群相关代谢信号可能影响皮质骨转录程序（包括代谢酶相关基因），从而在骨单位成熟过程中促成局部代谢重塑；这些变化伴随骨发育信号、ECM组织和骨细胞通讯相关通路的转录改变；免疫/炎症相关转录程序的变化提示免疫调节也可能参与该反应。
从转化医学角度看，骨单位组织可能代表了皮质骨质量中一个动态且具有生物学响应性的组成部分。骨单位成熟可在骨骼生长过程中受到实验性系统性扰动的影响，支持骨单位水平组织不仅是静态组织学特征、而可能对生物学环境变化产生响应的概念。这一以骨单位为中心的视角可能对依赖骨单位重塑或重建的病理和再生场景（包括骨质疏松和骨折修复）具有更广泛的相关性。
研究结论：早期肠道菌群紊乱会损害骨单位水平的皮质骨成熟并降低力学性能。骨单位组织可能代表了出生后骨骼发育过程中受肠道菌群紊乱影响的皮质骨质量的一个敏感层面。该研究建立了将早期肠道菌群紊乱与生长过程中皮质骨单位水平组织、局部分子重塑和骨力学性能联系起来的实验框架。
六、研究局限性
研究人员承认以下局限性：（1）匹配的多组学分析受限于小样本量，转录组-代谢组相关性应视为探索性结果；（2）AIMD方案虽以主要扰动肠道菌群为设计目标（利福昔明和新霉素胃肠道吸收极少），但甲硝唑可系统性吸收，无法完全区分菌群介导效应和抗生素特异性效应，未来需通过菌群恢复或移植实验确认因果关系；（3）研究聚焦于3月龄终点测量，限制了确定菌群紊乱、代谢重塑、转录变化和骨单位成熟之间时间顺序的能力；（4）非靶向代谢组学鉴定的候选代谢物（如PGF1α和DOC）需要靶向验证和功能测试确认其生物学相关性；（5）初级和次级骨单位结构的分类主要基于组织学形态，未来结合动态骨标记、更高分辨率三维成像和细胞特异性分子检测可进一步强化骨单位重塑的解释。
