低雌激素状态下垂体前叶细胞的整合性适应：基于VCD小鼠绝经模型的单细胞转录组与血清激素分析

《Frontiers in Endocrinology》：Integrated pituitary adaptations to the low estrogen state

引言： 雌激素对垂体前叶功能的广泛营养作用尚未被完全阐明。化合物4-乙烯基环己烯双环氧化物（4-vinyl cyclohexene diepoxide, VCD）可诱导早期卵巢功能衰竭并降低雌二醇（estradiol, E2）的产生，这可能对垂体前叶各类细胞产生差异性影响。研究人员近期在单细胞水平上鉴定了经VCD处理20天、处于无周期状态、血清雌二醇水平低下且138天后促性腺激素升高8–12倍的雌性小鼠垂体促性腺激素细胞的转录组变化。 材料与方法： 研究人员将溶剂对照与VCD处理的雌性小鼠置于代谢笼中，通过酶免疫分析法（enzyme immunoassay, EIA）检测血清激素水平，并通过实时定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）和单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）检测垂体细胞转录本。 结果： VCD处理的小鼠表现出正常的代谢健康状态。与对照组相比，VCD处理的雌性小鼠血清垂体促甲状腺激素（thyroid-stimulating hormone, TSH）水平升高5倍，而甲状腺激素水平接近正常。垂体Tshb mRNA水平降低，而垂体Gh、Prl和Pomc mRNA水平无变化。在处理开始后62天（围绝经期），VCD处理小鼠的血清生长激素（growth hormone, GH）水平高于对照组，随后在118–138天后降至对照水平。 ingenuity通路分析（Ingenuity Pathway Analyses, IPA）对上调差异表达基因（differentially expressed gene, DEG）转录本的分析预测，在一个生长激素细胞（somatotrope）亚群以及促甲状腺激素细胞（thyrotrope）和催乳素细胞（lactotrope）簇中，G蛋白介导的信号通路被激活。相反，促肾上腺皮质激素细胞（corticotrope）和其余两个生长激素细胞亚群中下调的DEG预测关键信号通路下调。 讨论： 垂体Gh、Prl和Pomc mRNA水平不变与血清水平不变相关。处理62天后血清GH的暂时性升高与围绝经期雌激素峰值反应的报道一致。垂体Tshb降低与近期报道的促性腺激素细胞中该基因表达降低相关。对促甲状腺激素细胞簇中上调DEG的IPA分析预测了支持血清TSH水平升高的经典信号通路激活。接近正常的甲状腺激素水平提示绝经期女性存在亚临床甲状腺功能减退。促肾上腺皮质激素细胞和两个生长激素细胞亚群中下调的DEG预测应激和代谢反应受损。最后，多激素基因表达降低提示在低雌激素环境中细胞可塑性受损。这些对持续低雌激素状态（如绝经期所见）的不同反应反映了雌激素营养作用的多样性。

论文解读

一、研究背景与科学问题

雌激素（雌二醇，estradiol, E2）在调控垂体前叶细胞功能中发挥重要作用，既可直接作用于垂体，也可通过下丘脑神经元间接发挥作用。已有充分研究证实，E2对垂体促性腺激素细胞（gonadotropes）具有负反馈和正反馈调控作用，参与调控黄体生成素（luteinizing hormone, LH）和促卵泡激素（follicle-stimulating hormone, FSH）的分泌；E2还可刺激催乳素细胞（lactotropes）增殖并促进催乳素（prolactin, PRL）的合成与释放。然而，E2对垂体其他细胞群体——包括促甲状腺激素细胞（thyrotropes）、促肾上腺皮质激素细胞（corticotropes）和生长激素细胞（somatotropes）——的调控作用尚不明确。已有研究表明，E2可直接刺激促甲状腺激素（thyroid-stimulating hormone, TSH）的分泌，促进促甲状腺激素释放激素受体（thyrotropin-releasing hormone receptor, TRHR）的表达，调节促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropin, ACTH）的产生及对应激激素释放激素（corticotropin-releasing hormone, CRH）的反应，并直接刺激生长激素（growth hormone, GH）的合成。

在女性衰老过程中，E2水平显著下降35–50%，其影响远不止于生殖功能的衰退。绝经期女性中，E2降低与血清GH下降相关，具体表现为GH脉冲幅度降低；垂体促肾上腺皮质激素细胞参与激素波动和潮热引起的应激反应，可加重情绪波动和失眠；甲状腺疾病在绝经期也更为普遍，影响分泌TSH的促甲状腺激素细胞。事实上，以TSH升高但甲状腺激素水平正常为特征的亚临床甲状腺功能减退已被发现与围绝经期和绝经期女性的血脂异常相关。然而，垂体对持续低E2状态反应的潜在机制仍不清楚，因此需要建立合适的动物模型来深入研究这一科学问题。

二、研究设计与技术方法

研究人员采用4-乙烯基环己烯双环氧化物（4-vinyl cyclohexene diepoxide, VCD）诱导成年雌性小鼠早期卵巢功能衰竭和E2产生减少，以此作为绝经模型。研究使用了FVB.129P2-Pde6b⁺ Tyr^c-ch/AntJ杂交品系小鼠，将28只3–4月龄雌性小鼠分为VCD处理组和溶剂对照组，VCD组连续20天腹腔注射VCD（160 mg·kg^-1·day^-1），对照组仅注射芝麻油。研究在VCD处理开始后133–138天收集垂体组织，每组6个垂体用于单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq），每组3只动物为一个池，共两个池。血清样本通过酶免疫分析（enzyme immunoassay, EIA）检测激素水平。主要技术方法包括：Luminex 200平台和Millipore Sigma Milliplex检测试剂盒用于检测血清垂体激素（催乳素、GH、ACTH、TSH）和甲状腺激素（甲状腺素T₄和三碘甲状腺原氨酸T₃）；实时定量PCR（qRT-PCR）检测垂体mRNA水平；10x Genomics Chromium平台进行单细胞3′文库构建，Illumina NovaSeq 6000平台测序，Cell Ranger和Seurat进行生物信息学分析；Ingenuity Pathway Analysis（IPA）进行差异表达基因（differentially expressed gene, DEG）的通路和上游调控因子预测。此外，研究还使用Comprehensive Lab Animal Monitoring（CLAMS-Oxymax）代谢笼评估小鼠代谢健康状况。

三、研究结果

3.1 血清激素水平

VCD处理后138天，质谱分析确认E2水平降低，小鼠不再具有动情周期。促性腺激素（LH和FSH）水平为对照组的8–15倍，这是E2对下丘脑GnRH神经元负反馈减弱所致。血清GH呈现双相变化：处理开始后62天（围绝经期），VCD处理组GH水平升高，这与围绝经期FSH升高引起的雌激素峰值反应一致；在118天和138天，GH水平急剧下降，且对照组和VCD处理组均出现此下降，提示可能与衰老相关而非VCD处理特异。与对照组相比，138天VCD处理组血清TSH水平显著升高5倍，T₄和T₃水平略有升高（仅单尾t检验达到显著水平），这种TSH升高伴甲状腺激素正常或接近正常的模式与绝经期女性亚临床甲状腺功能减退的特征一致。血清催乳素和ACTH平均水平在两组间无显著差异。

3.2 代谢健康分析

CLAMS代谢笼检测显示，VCD处理组雌性小鼠在光照期呼吸商（respiratory quotient, RQ）略有降低，提示优先利用碳水化合物作为能量来源；能量消耗在光照期和黑暗期均略有降低。两组的活动量（水平活动、垂直跳跃/站立）和睡眠时间百分比均呈现正常的昼夜节律模式，组间无差异。总体而言，VCD处理小鼠代谢状态接近正常，表明VCD处理没有持久的全身毒性效应。

3.3 单细胞转录组对VCD处理的反应

通过Seurat聚类分析，研究人员在8861个细胞中鉴定了垂体内分泌细胞和干细胞群体，其中生长激素细胞分为三个亚群（SOM1、SOM2、SOM3），催乳素细胞分为四个亚群（LAC1、LAC2、LAC3、LAC4），促甲状腺激素细胞和促肾上腺皮质激素细胞各为一个群体。VCD处理导致SOM1细胞比例降低26%，SOM2和SOM3分别增加9%和25%，生长激素细胞总体比例降低10%；催乳素细胞总体比例降低14%；促肾上腺皮质激素细胞比例降低22%。

3.4 垂体激素mRNA水平分析

qRT-PCR检测显示，总垂体Ghrhr mRNA水平无变化，但单细胞数据显示SOM1簇中Ghrhr mRNA显著降低；Gh、Prl和Pomc mRNA在总垂体中均无显著变化；Tshb mRNA在总垂体中显著降低，且此降低与促性腺激素细胞簇中Tshb的显著降低相关；Trhr和Pomc mRNA在总垂体中无变化。

3.5 生长激素细胞的差异基因表达

VCD处理导致所有生长激素细胞亚群中催乳素标记基因Prl表达显著降低，但Gh mRNA在各亚群中均无变化。IPA分析显示，SOM1簇中与GH分泌相关的CREB、G蛋白、ERK/MAPK和雌激素受体信号通路预测上调，而SOM2和SOM3簇中这些通路预测下调。SOM1中Ghrhr mRNA降低，而SOM2和SOM3中未检测到该变化。IPA还预测SOM1中蛋白转运、氧化磷酸化和细胞存活相关通路上调，凋亡下调；SOM2和SOM3中则呈现相反趋势。上游调控因子分析显示，雌二醇是SOM1中多个上调DEG的预测调控因子，而SOM2和SOM3中相应靶基因下调，可能与miRNA上调有关。G蛋白偶联受体通路分析显示，SOM1中STAT3等基因上调预测JAK/STAT通路激活，而SOM2中PAK和PI3K等关键分子下调预测通路失活，SOM3中G蛋白、STAT3、MAP3K等下调预测功能受损。

3.6 催乳素细胞的差异基因表达

尽管催乳素细胞总体比例降低14%，但各催乳素细胞亚群中Prl表达无显著变化，血清催乳素水平和总垂体Prl mRNA含量也无变化。IPA预测LAC1、LAC2和LAC3中多种基础细胞过程（包括转运、分选、有丝分裂和信号传导）上调，细胞死亡、凋亡和坏死下调。G蛋白偶联受体通路和磷脂酰肌醇激酶通路预测上调，这些通路是催乳素释放所必需的。LAC1中多个上调DEG支持G蛋白和下游通路的激活；LAC2中Pi3k降低被预测会损害该通路；LAC3中Pi3k、Mapk和Stat3上调。雌激素受体信号通路分析显示，涉及催乳素分泌信号传导的钙通道亚基、腺苷酸环化酶、G蛋白、MAP激酶和IP₃通路相关基因在催乳素细胞中大部分预测上调。研究提示，尽管催乳素细胞比例下降，但在低E2环境中催乳素细胞仍能维持催乳素的合成和分泌，TRH可能是潜在的候选上调因子。

3.7 促甲状腺激素细胞的差异基因表达

促甲状腺激素细胞簇在总垂体细胞中占比很小，Tshb也在促性腺激素细胞群体中检测到表达（但不表达Trhr）。总垂体Tshb在VCD处理组中降低，单细胞促甲状腺激素细胞簇中Tshb无显著变化，但在促性腺激素细胞簇中显著降低。IPA预测促甲状腺激素细胞中多种经典通路被激活，包括有丝分裂活性、蛋白质翻译、折叠和分选，与TRH刺激一致；同时预测细胞存活和活力增加、凋亡下调，与血清TSH水平升高一致。促甲状腺激素细胞与催乳素细胞的比较分析显示两者存在共同激活的通路和生物过程。雌激素受体信号通路中，促甲状腺激素细胞中蛋白激酶C（Pkc）、PKA亚基（Prkar1b）和热休克蛋白90（Hsp90）的降低被预测影响多个下游通路。甲状腺激素受体α和β在LAC1和LAC2中预测上调，但在促甲状腺激素细胞簇中无此变化。仅激活转录因子3（Atf3）在所有四个催乳素细胞簇中均上调，该基因在SOM1和SOM2中也上调。总体而言，促甲状腺激素细胞群体被预测处于刺激状态，与血清TSH升高相符，但全垂体Tshb mRNA的降低与促性腺激素细胞中Tshb的显著降低相关。

3.8 促肾上腺皮质激素细胞的差异基因表达

血清ACTH水平和总垂体Pomc mRNA在VCD处理组中无变化，各单细胞簇（包括促肾上腺皮质激素细胞簇）中Pomc mRNA也无显著变化。VCD处理导致促肾上腺皮质激素细胞比例降低22%，这与E2刺激促肾上腺皮质激素细胞增殖的潜在作用一致。IPA分析基于下调的DEG预测β-连环蛋白非依赖性WNT信号通路、蛋白激酶A信号通路和JAK/STAT信号通路在促肾上腺皮质激素细胞簇中下调；基于上调的DEG预测翻译通路和G蛋白及CREB信号通路上调，与血清ACTH分泌维持一致。促肾上腺皮质激素细胞与促甲状腺激素细胞的雌二醇靶DEG比较显示，两个基因（Tra2b和G6pdx）在两种细胞中均上调，无共同下调基因。

四、讨论与结论总结

本研究利用VCD模型使成年雌性小鼠血清E2水平逐渐降低，模拟绝经样状态，研究了垂体生长激素细胞、催乳素细胞、促甲状腺激素细胞和促肾上腺皮质激素细胞对持续低E2状态的差异性反应。研究显示这些小鼠代谢状态接近正常，表明VCD处理无持久的全身毒性效应。最值得关注的发现是VCD处理组血清TSH显著升高，这与围绝经期和绝经期女性亚临床甲状腺功能减退的报道一致。垂体Tshb mRNA的降低与促性腺激素细胞中该基因表达降低相关，而促甲状腺激素细胞中上调的DEG预测支持血清TSH升高的经典信号通路激活。接近正常的甲状腺激素水平提示绝经期女性可能存在亚临床甲状腺功能减退。血清GH在围绝经期（62天）暂时升高后降至对照水平，与围绝经期雌激素峰值的报道一致。促肾上腺皮质激素细胞和两个生长激素细胞亚群中下调的DEG预测应激和代谢反应受损。多激素基因表达降低提示低雌激素环境中细胞可塑性受损。这些不同的反应反映了雌激素营养作用的多样性——不同垂体细胞类型对持续低雌激素状态表现出各自独特的适应性变化，为理解绝经期广泛的生理影响提供了新的机制视角。