《Frontiers in Pharmacology》：Cellular memory after cancer therapy: persistence after drug withdrawal, maintenance across cell divisions, and responses to rechallenge
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一部分肿瘤细胞可以在不获得稳定耐药突变的情况下存活于治疗压力之下，进入一种药物耐受持久态（drug-tolerant persister, DTP）。撤药后，这些细胞可能恢复增殖并重新获得药物敏感性，保留在再次治疗时改变生存或死亡的表型特征，或继续向稳定耐药方
一部分肿瘤细胞可以在不获得稳定耐药突变的情况下存活于治疗压力之下，进入一种药物耐受持久态（drug-tolerant persister, DTP）。撤药后，这些细胞可能恢复增殖并重新获得药物敏感性，保留在再次治疗时改变生存或死亡的表型特征，或继续向稳定耐药方向演化。DTP这一称谓描述了治疗压力下的存活，但并未确定该相关状态是否在治疗结束后持续存在。本文中，“治疗后细胞记忆”（post-treatment cellular memory）一词被操作性地定义为一种治疗相关的状态，该状态在充分的药物洗脱后仍可被检测到，并能影响后续的治疗应答。证据可从三个实验维度进行评估：撤药后的持久性、在后续细胞分裂或克隆后代中的维持，以及再暴露时的功能性后果。这些维度指示了不同程度的支持强度，而非强制性的诊断标准。因此，本综述根据撤药后实际测量的指标（而非仅依据DTP标志物或机制）来组织代表性研究。近期研究表明，激活蛋白-1（AP-1）有助于编码治疗相关的转录状态，而CREB结合蛋白/p300（CBP/p300）活性有助于维持已建立的报告基因状态，包括在撤药之后；然而，分子层面的持久性并不能替代在原始药物再挑战时证明功能改变的实验。染色质重塑、转录状态转换、抗氧化代谢、自噬、细胞器稳态和谱系可塑性可能延长残留细胞的存活。这些生物学后果各不相同：某些状态在撤药后消退，某些产生对铁死亡（ferroptosis）或靶向抗凋亡依赖性的治疗的时间有限脆弱性，另一些则延长了基因耐药得以出现的时间窗口。谱系示踪、单细胞多组学、撤药-再挑战实验以及对微小残留病的纵向采样，有助于区分短暂的应激反应与持久的治疗后状态。这些观察结果为检验治疗顺序以及在残留病期间干预措施能否匹配残留状态的可逆性与脆弱性提供了理论依据。
2 建立治疗后的持久性：撤药、传代与再挑战
治疗期间的存活仅证明了在该时间条件下存在的耐受性。Sharma等发现，撤药后重新生长的DTP恢复了原始药物的敏感性，表明至少部分耐受状态在治疗压力移除后会消退。当分子或表型差异在后续细胞分裂或克隆后代中仍然存在，并在再次治疗时改变存活、死亡或增殖时，治疗后持久性的证据最强。目前DTP研究中关于撤药间隔和可逆性测试的要求仍不一致，导致不同模型之间的比较困难。稳定的突变或持久的不可逆表观遗传改变反而会固定耐药，其生物学基础与可消退的治疗后状态截然不同。
观察时长应反映所用肿瘤模型的倍增时间和治疗方案；单一的以天数表达的撤药间隔不太可能适用于所有情况。治疗后检测到相同的转录特征，可能反映了原始克隆的持续扩增或多个克隆趋同于相似的状态。结直肠癌和乳腺癌模型中的条形码示踪研究表明，克隆起源、增殖状态和转录程序可在残留群体内同时发生变化。将未经处理的细胞进行相同培养和传代，有助于排除长期培养引起的状态漂移，而再次治疗后的细胞数量变化应区分为增殖减少和细胞死亡。再挑战实验还应扩展到原始药物之外，因为在特定模型中，药物耐受和免疫治疗持久的细胞表现出跨治疗模式的耐受性。
仅凭治疗期间降低DTP丰度，并不能证明某种染色质或代谢机制维持了治疗后的状态。拉帕替尼撤药后，重新生长的细胞对谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）抑制的敏感性至少保留了2周，随后这种脆弱性逐渐减弱，这表明治疗后的脆弱性本身也会随时间变化。当某种机制的扰动加速了撤药期间表型的消退并恢复再挑战时的敏感性时，该机制更强烈地被暗示参与了持久性。残留药物、增殖差异以及小克隆的扩增可能产生类似的观察结果，应通过洗脱、细胞死亡测量和谱系信息加以评估。
在三阴性乳腺癌患者来源异种移植瘤中获得了直接的撤药-再生长的证据。多柔比星联合环磷酰胺处理后的残留肿瘤保留了未治疗肿瘤的亚克隆结构，但显示出独特的分子和组织学状态；治疗停止后，它们作为化疗敏感的肿瘤重新生长，类似于未治疗的对照组。这支持了一种可逆的、基本非选择性的耐受状态，但并未证明某个特定的分子程序在整个无药间期内保持了功能性活跃。
时间分辨的化疗模型进一步将早期自噬相关的耐受反应与后期伴随初始DNA修复程序逆转的持久性区分开来。这些发现表明，短期和长期的存活终点可能代表生物学上截然不同的反应，不应被视为可互换的持久性定义。
3 治疗压力下细胞状态的形成与持久性
3.1 预先存在的细胞状态与治疗诱导的重编程
细胞群体在治疗前并非均一。在黑色素瘤中，一小部分细胞瞬时高表达耐药相关基因。虽然这些细胞最初不具备稳定耐药性，但它们更有可能在药物暴露中存活并进行进一步的表观遗传重编程，最终获得稳定的耐药表型。因此，治疗前的瞬时变异可以影响早期存活，此后药物暴露进一步重塑存活的细胞。
其他模型表明，进入DTP状态并不局限于少数预定克隆。在化疗作用下，结直肠癌细胞可以采用一种胚胎滞育样状态。复发肿瘤在经过DTP阶段后仍保留了大量的条形码复杂度，表明许多克隆都能进入此状态。在此阶段，细胞减少增殖并依赖于自噬生存。因此，治疗前状态和治疗诱导的变化常常共同促进DTP的形成，其相对重要性因癌症类型、药物和暴露时长而异。
3.2 染色质和转录状态中编码治疗经历
促进进入或存活于DTP状态的机制应与在撤药后保持治疗相关状态的机制区分开来。DTP的可逆性将其稳定性置于即时信号响应与永久性遗传改变之间。Sharma等发现DTP状态依赖于赖氨酸特异性去甲基化酶5A（KDM5A）及其相关的染色质变化，并且单个细胞可以低频地进入和退出此状态。在黑色素瘤中，具有瞬时耐药基因表达的细胞在药物暴露过程中也经历了更持久的转录和染色质重编程。这些发现暗示了染色质调控在DTP形成和状态转换中的作用，但它们本身并不能证明撤药后的维持。
一项曲美替尼模型进一步显示，治疗历史可以重定向预先存在的转录状态的命运。细胞短暂暴露于地塞米松，随后撤药并引入曲美替尼；一个月后，初始诱导的基因仍保持较高表达。双报告系统和活细胞追踪还表明，治疗开始时存在的随机表达差异可以在耐药克隆中保留。低剂量暴露期间的AP-1抑制减少了随后对高剂量治疗的耐受性，而已建立的报告基因状态的维持依赖于CBP/p300的乙酰转移酶活性和溴结构域。这些实验将治疗开始时的表达状态与耐药克隆后代联系起来，并提示状态的形成和维持可能依赖于部分不同的机制。单独的报告基因实验还表明，在2周曲美替尼暴露后，已建立的AP-1报告基因状态在3周的无药随访期间仍可检测到。然而，该研究并未测试保留的状态是否改变了曲美替尼重新引入时的应答；因此它支持的是撤药后的分子持久性，而非完整的功撤药-再挑战验证。
增强子重塑、染色质可及性改变、转录因子转换和RNA调控都被认为与DTP存活有关。这些变化通常以相互作用网络的形式发生。它们与治疗后记忆的相关性取决于特定组合是否在撤药后持续存在，并能预测再挑战时的应答。图2A、B将支持治疗期形成或存活的机制与撤药后维持的候选机制进行了区分。
在表皮生长因子受体（EGFR）突变的肺癌中，联合EGFR和丝裂原活化蛋白激酶（MEK）抑制可揭示一种衰老样休眠群体，其中YAP/TEAD活性参与调控SLUG并抑制促凋亡因子BMF。独立的全基因组CRISPR筛选也确定了Hippo通路调节因子是奥希替尼或吉非替尼持久性的决定因素，而患者来源和免疫活性模型则在EGFR、ALK和KRAS导向的治疗中揭示了黏着斑激酶（FAK）-YAP信号模块的作用。这些研究建立了治疗期间模型特异性的存活机制；但没有一项研究单独证明了同一状态在撤药后持续存在并改变了再挑战应答。
其他研究表明，染色质控制不能简化为单一调节因子。PRDM9依赖的H3K4me3支持胶质母细胞瘤干细胞模型中的胆固醇生物合成程序和化疗耐受，而患者来源的三阴性乳腺癌模型则汇聚于部分由FOSL1/AP-1调控的基础角蛋白、应激和炎症程序。这些机制扩展了图2，但仍具有背景依赖性，不应被视为通用的维持机制。
3.3 DTP的代谢、自噬和谱系异质性
DTP不仅仅是停止分裂。处于治疗压力下的残留细胞必须重组能量供应、氧化还原平衡和细胞器质量控制。来自多种癌症谱系的持久细胞对GPX4抑制和铁死亡表现出高度敏感性，表明防止脂质过氧化至少是部分DTP的存活依赖性。铂类耐受性卵巢癌中FZD7标记的细胞同样易受铁死亡影响。结直肠癌中滞育样的DTP则依赖于自噬来回收细胞内组分。残留乳腺癌病灶中持续的代谢变化进一步表明，代谢状态可以在治疗结束后持续一段时间。
残留群体本身具有异质性。利用Watermelon条形码技术同时记录克隆起源、增殖状态和转录特征，Oren等发现增殖性和非增殖性持久细胞来源于不同的谱系。增殖性持久细胞具有更强的抗氧化程序并更多地利用脂肪酸氧化。黑色素瘤的微小残留病也包含几种可相互转换的状态。维甲酸X受体（RXR）信号传导促进了神经嵴样状态的形成，其抑制可减少这些细胞的积累并延缓耐药。因此，治疗后持续的细胞包含多个具有不同增殖能力和代谢依赖性的群体。
功能研究同样确定了残留群体中非重叠的脆弱性。ALDH1A3-mTOR信号支持化疗耐受的胃癌细胞；FSP1连接的脂质和铁稳态与顺铂耐受的头颈癌模型相关；BET抑制优先耗竭已重新进入细胞周期的持久细胞，并延迟黑色素瘤和肺癌模型中的复发；蛋白质精氨酸甲基转移酶1（PRMT1）缺失减少了选定肺癌系统中EGFR或KRASG12C靶向治疗期间的持久性。这些观察结果支持针对状态匹配的干预策略，而非单一的泛DTP靶点。
这些非重叠的依赖性使联合方案的设计复杂化。单一的泛DTP靶点可能会放过由不同程序维持的状态，而同时治疗只有在脆弱状态在同一模型和同一时间共存时才合理。当持久状态随时间出现或相互转换时，序贯治疗可能更为合适。在推进任一策略之前，相关模型应建立同一模型内的共存性、状态转换动力学、药理学拮抗作用和联合毒性。目前，这些考虑为状态指导的联合实验提供了临床前理论基础，而非临床治疗建议。
3.4 撤药后状态消退与交叉治疗耐受
撤药实验可以直接证明DTP状态是否会消退。Sharma等观察到撤药后重新生长的细胞恢复了原始药物的敏感性。这种恢复表明至少部分DTP不会变成永久耐药。某些治疗后的脆弱性可以持续更长时间。拉帕替尼撤药后，重新生长的细胞对GPX4抑制剂RSL3的敏感性至少保持了2周，随后这种敏感性在更长的时间间隔内逐渐下降。因此，对原始药物敏感性的恢复和新获得的脆弱性的丧失可能以不同的速率进行。
一种治疗后的持续变化也可能影响对另一种治疗的应答。在实验模型中，药物耐受和免疫治疗持久的细胞均表现出对线粒体凋亡的敏感性降低，有些还对放疗、药物或嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞攻击表现出交叉耐受。该证据目前主要来自选定的细胞和动物模型，不能证明交叉治疗耐受是普遍现象。但它表明再挑战实验不应仅限于原始药物。
3.5 DTP存活延长了基因耐药出现的时间窗口
在EGFR突变肺癌中，T790M耐药可通过两种不同的途径出现。治疗前已存在的T790M阳性克隆可早期扩增，而最初缺乏T790M的DTP可能存活足够长的时间以获得该突变并随后发展为稳定耐药。黑色素瘤中也存在类似的连续过程：首先，一种瞬时的预耐药转录状态增加了存活概率，随后治疗诱导的重编程逐步稳定了耐药。
这些发现并不表明非遗传耐受直接诱导了特定突变。DTP可以延长治疗压力下的存活时间，为随后的多样化、克隆扩增和选择提供时间。在无药培养中保持稳定且无已鉴定遗传改变的表型，不应与携带如T790M等改变的遗传介导的耐药相混淆。预先存在的耐药克隆可能在治疗开始后不久即被选择和扩增，这为在存在可靶向改变时研究基线或早期检测及前期抑制提供了理由。相比之下，DTP衍生的耐药需要经过更长的残留病间隔期的存活、多样化和选择，为测试针对持久细胞库或其进化能力的干预措施提供了理由。这些区别产生了可检验的时序安排假说，而非既定的给药规则，并且两种途径都不能从单一的进展后样本中推断出来。
持久细胞衍生的耐药也具有异质性。源自单一EGFR成瘾持久细胞的厄洛替尼耐药集落获得了多种临床上公认的耐药机制，单细胞转录组和染色质分析识别出分化的耐受-耐药轨迹，其中包括CD74相关的存活。最近，EGFR抑制期间载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3（APOBEC3）的诱导被发现能促进持久细胞存活并改变T790M获得和鳞状转分化的概率。这些研究支持了一种储库式的进化模型，但它们并不意味着每个持久细胞都会获得突变，或者一种耐受状态决定了唯一的耐药基因型。
4 通过谱系示踪和纵向采样区分克隆选择与状态转换
单一时间点测量的转录组只描述了采样时的状态，无法确定该状态是通过治疗前克隆的选择还是治疗诱导的细胞转变产生的。条形码、可遗传示踪剂和克隆追踪可以记录细胞起源，而单细胞转录组学、染色质可及性、蛋白质组学和代谢组学可以比较同一谱系在治疗前、暴露期间、撤药后以及再挑战后的状态。双报告基因活细胞追踪可以进一步将治疗开始时的表达差异与个体耐药克隆联系起来，测试初始状态是否在其后代中保留。这些方法结合起来，可以将克隆丰度的变化与克隆内部的状态变化区分开来。
实验报告应详细说明药物剂量、暴露时长、撤药间隔、细胞分裂次数和再挑战条件。功能终点应超出存活分数，包括细胞死亡方式、克隆扩增、分化轨迹和再次治疗时的剂量反应。对候选维持机制的抑制、恢复和拯救实验可以进一步区分其在治疗期间存活中的作用与在撤药后状态持久性中的作用。图1C总结了区分状态保留与残留药物、克隆选择和稳定耐药所需的设计特征。
从临床样本中获得纵向信息更为困难。一个有信息量的设计应将治疗前组织与早期治疗期间、影像学缓解时的微小残留病以及复发时的样本配对。黑色素瘤研究表明，微小残留病包含多种细胞状态并显示出空间异质性。泛癌转录组学分析也已在化疗后多种肿瘤模型中识别出共享的残留病程序。谱系和克隆追踪对于区分选择与克隆内部状态变化仍然是必要的。
