高温加剧创伤弧菌（Vibrio vulnificus）所致美洲鳗（Anguilla rostrata）红 sore 病（RSD）的实证研究：柯赫法则验证与温度风险量化

《Frontiers in Microbiology》：Elevated temperature exacerbates red sore disease caused by Vibrio vulnificus in American eels (Anguilla rostrata)

　　

海洋致病菌创伤弧菌（Vibrio vulnificus）与一种皮肤溃疡性疾病的流行相关，该病在欧洲鳗（Anguilla anguilla）和日本鳗（Anguilla japonica）中造成高死亡率。美洲鳗（Anguilla rostrata）也经历类似病症，通常称为红 sore 病（RSD）。野外研究表明，创伤弧菌感染与美洲鳗RSD高度相关，但因果关系尚未确立。在本研究中，研究人员对临床健康的美洲鳗腹腔注射创伤弧菌，随后在18、25或32°C条件下饲养12天。特征性临床症状的出现、死亡率以及一致的细菌再分离结果满足了柯赫法则（Koch's postulates）的要求，证实创伤弧菌是美洲鳗RSD的病原体。大体临床症状包括充血、出血、表皮侵蚀以及伴有皮下组织坏死的浅表至深部溃疡。组织病理学显示革兰氏阴性菌广泛定殖；表皮和真皮（包括鳞片）部分至完全缺失；以及受影响组织出现水肿、出血、肌坏死和大量白细胞浸润（炎症）。注射创伤弧菌的鳗鱼死亡几率是对照组的92倍。高温是额外的风险因素，在32°C下注射创伤弧菌的鳗鱼死亡几率比18°C下高13倍。这与体外（in vitro）观察到的创伤弧菌在较高温度下生长加快直接相关。这些发现确定了温度是美国野生美洲鳗种群RSD风险的重要驱动因素，也是美国切萨皮克湾地区鳗鱼养殖中缓解该病的重点方向。

论文解读文章

一、研究背景与目的

红 sore 病（RSD）是美洲鳗（Anguilla rostrata）养殖业中新出现的一种传染病，在美国弗吉尼亚州切萨皮克湾地区的鳗鱼养殖和临时暂养设施中造成高死亡率，野生鳗鱼种群中也有类似病症报告。RSD的皮肤病理表现包括充血、广泛出血、鳞片脱落、表皮侵蚀以及暴露下层肌肉或骨质的浅表至深部坏死性皮肤病变。

20世纪80年代北美鳗鱼养殖研究曾将嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）和杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）鉴定为RSD的病原体。然而，近期研究发现，除了气单胞菌外，弧菌属（Vibrio spp.）感染与养殖RSD密切相关，其中创伤弧菌（Vibrio vulnificus）在严重和全身性感染中占主导地位。这一发现与欧洲和日本鳗鱼养殖中的疾病报告一致，在这些地区，欧洲鳗（Anguilla anguilla）和日本鳗（Anguilla japonica）中临床相似的疾病被确定由弧菌属（主要是创伤弧菌）感染引起。

尽管存在强烈的临床和流行病学关联，但切萨皮克湾美洲鳗RSD暴发与创伤弧菌之间的因果关系尚未通过受控实验室实验直接确立。此外，弧菌属是机会性病原体，鱼类细菌性RSD通常与水质不佳有关。在应激条件下，弧菌属等细菌引起的局部皮肤感染可转为全身性感染，导致内部血液过滤器官坏死并引发急性死亡。温度尤其被发现与弧菌属感染导致的鳗鱼死亡率增加相关。此前研究还观察到，在美洲鳗养殖作业中，检测到弧菌属的几率随温度升高而增加，在25°C以上时成为优势细菌病原体。

基于此，研究人员开展了体内（in vivo）实验室暴露实验，旨在：（1）通过应用柯赫法则确认创伤弧菌是RSD的病原体；（2）评估温度对RSD临床严重程度的影响。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员从2020年切萨皮克湾约克河商业捕捞的、表现出轻度RSD临床症状并携带全身性感染（肝脏和脾脏）的鳗鱼脾脏中无菌采集获得创伤弧菌分离株AK-2020-508B。该菌株经16S rRNA基因测序和全基因组测序确认身份，其gyrB和lysB基因序列与西班牙欧洲鳗中分离的创伤弧菌CECT4999有100%匹配。

实验使用约375尾来自美国康涅狄格州养殖场、主要从切萨皮克湾东部湾商业捕捞的美洲鳗（平均体长33.8 ± 4.9 cm，体重55.9 ± 26.9 g）。鳗鱼经福尔马林浴处理清除外部寄生虫，剔除患病个体后检疫3个月。159尾鳗鱼随机分配到6个循环水养殖系统中，分别接受以下处理：（1）病原体+低温（18°C）、（2）无病原体+低温（18°C）、（3）病原体+最适温度（25°C）、（4）无病原体+最适温度（25°C）、（5）病原体+高温（32°C）、（6）无病原体+高温（32°C）。病原体处理组通过腹腔注射（IP）给予100 μL浓度为7.5 × 10⁴ CFU/mL的创伤弧菌TSB培养液，对照组注射经0.22 μm过滤的相同无菌TSB。实验持续12天，每日检查两次，死亡或濒死鳗鱼被取出进行尸检、细菌学和组织病理学采样。

主要技术方法包括：体外（in vitro）生长动力学实验（在不同温度20、27、35°C和盐度0、10、20 ppt下测量OD₆₀₀作为细菌生长指标）；细菌分离与分子鉴定（16S rRNA Sanger测序和全基因组测序）；组织病理学检查（H&E染色）；以及统计学分析（广义线性混合效应模型GLMM，以生存状态为响应变量，病原体暴露状态和温度为固定因子，水箱为随机效应）。

三、研究结果

3.1 体外创伤弧菌生长动力学

在7小时培养过程中，创伤弧菌分离株AK-2020-508B在35°C下生长最快，27°C次之，20°C下生长极微。35°C下培养物在3-4小时进入指数生长期，27°C下为5-6小时。在相同温度下，10和20 ppt盐度下的生长相当，但在0 ppt盐度下无论温度如何均无生长。另外两个分离株（AK-2020-515C、AK-2021-C-C）观察到相似的生长动力学。

3.2 鳗鱼存活率

鳗鱼存活率受病原体注射和温度的显著影响。注射创伤弧菌的鳗鱼死亡几率是对照组的92倍（95% CI: 8.6–984，p < 0.001）。对照组几乎无死亡，仅32°C对照组有4尾（16.7%）死亡。在注射创伤弧菌的鳗鱼中，32°C下死亡几率是18°C下的13.2倍（95% CI: 3.2–55.2，p < 0.001）。25°C与18°C相比存在更高的死亡趋势但未达统计显著（p = 0.11）。死亡动力学也随温度升高而加速：18°C下死亡始于第3天，25°C下第2天达峰，32°C下第1天即达峰且80%以上死亡发生在实验前2天内。

3.3 临床症状与病理学

注射创伤弧菌后出现的RSD外部临床症状包括出血、表皮侵蚀和浅表至深部病变，通常在注射部位附近。临床症状在感染后24小时内出现，第2-3天达高峰。在33尾死亡并采样的创伤弧菌注射组鳗鱼中，10尾在注射部位或附近出现病变。外部临床症状在25°C创伤弧菌处理组中最为常见（19尾中14尾），而在32°C（12尾中1尾）和18°C（11尾中3尾）处理组中发生率较低。对照组鳗鱼未出现符合RSD的临床症状。

组织病理学显示疾病进展的清晰模式：早期病变表现为局部至多灶性肿胀和充血，鳞片丢失、表皮部分缺失以及真皮和皮下组织水肿；随着严重程度进展，坏死皮肤组织与身体分离，最晚期病变中皮肤各层均被侵蚀，暴露下层肌肉组织。炎症反应随病变严重程度进展：早期病变中表皮出现少量单核细胞，对应肌肉平面上的细菌菌落；晚期病变中炎症延伸至皮下组织和肌肉深层，伴有局灶性肌坏死；表皮内和真皮内出现明显的单核吞噬细胞反应。在皮肤侵蚀边缘观察到表皮细胞增殖，表明宿主试图闭合创口。所有鱼中肝脏和脾脏的炎症和坏死大多轻微，但常在血管中观察到细菌。所有观察到的细菌均为革兰氏阴性。

3.4 细菌学与序列鉴定

从33尾创伤弧菌注射组死亡鳗鱼的注射部位病变、肝脏和脾脏中均成功再分离出细菌，纯培养物为直径约2 mm的不透明浅黄色菌落，经16S rRNA Sanger测序鉴定为弧菌属。从25°C病原体处理组一尾鱼病变中 recovered 的分离株AK-2021-E21C经全基因组测序确认为创伤弧菌，与实验感染所用原始分离株AK-2020-508B一致。32°C对照组死亡的两尾鳗鱼中仅一尾肝脏培养阳性。创伤弧菌注射组9尾存活采样鳗鱼中2尾培养出细菌（一尾来自18°C处理组尾柄病变，一尾来自25°C处理组深部病变鱼的肝脏）。对照组存活鳗鱼均未分离出细菌。

四、讨论与结论

本研究首次通过满足柯赫法则，确认了来自北美的创伤弧菌分离株是美洲鳗RSD的病原体。实验结果与欧洲和亚洲的发现一致，在这些地区，鳗鱼中与RSD相似的溃疡性疾病被归因于创伤弧菌生物型2。本研究所用菌株与西班牙患病鳗鱼肾脏中分离的生物型2/血清型E菌株创伤弧菌CECT4999在全基因组测序上高度匹配。

实验期间许多鳗鱼出现了RSD典型临床症状，但部分动物虽呈败血症状态却在无临床症状的情况下死亡。临床症状在中间温度（25°C）处理组中最常见，而在最高温度（32°C）下罕见，这可能表明高温下鳗鱼死亡过快，来不及表现临床疾病进展，而在热最适温度下鳗鱼能够控制感染。

温度对创伤弧菌感染的影响机制尚不完全确定。体外实验显示细菌在32°C下比18°C下生长更快，表明高温下创伤弧菌增殖加快可能提高了死亡率。高温诱导的应激反应也可能通过皮质类固醇作用损害鱼类的天然防御机制，影响淋巴细胞数量和抗体产生能力，使鳗鱼更容易受到感染并降低免疫清除能力。

本研究结果对疾病缓解具有重要意义。鉴于美洲鳗能耐受广泛的盐度和温度范围，在受控的低温淡水条件下进行美洲鳗养殖可能有助于减轻创伤弧菌引起的RSD相关死亡率。此外，由于气候变化导致的高温区域可能经历野生美洲鳗中创伤弧菌流行率和RSD严重程度的增加。创伤弧菌（此处鉴定的生物型2）也能感染人类，构成双重威胁——对鳗鱼的高致病性以及对人类健康的增加风险。近年来美国创伤弧菌伤口感染增加了八倍，病原体范围迅速北扩，非食源性环境和伤口暴露已成为主要感染途径。这些趋势凸显了创伤弧菌感染在美国日益加重的公共卫生负担，预计到2100年该病原体将在美国东部各州均有分布。