SPP1+巨噬细胞经SPP1?CD44轴驱动结直肠癌肝转移新辅助化疗耐药并构筑空间免疫屏障

《Molecular Biomedicine》：Characterization of SPP1?+?macrophages and their correlation with resistance to neoadjuvant chemotherapy in colorectal cancer liver metastasis

结直肠癌肝转移（CRLM）的新辅助化疗（NAC）仍是重大临床挑战，患者结局差异显著，而治疗耐药机制尚未充分阐明。研究人员整合患者肿瘤标本的单细胞RNA测序（scRNA?seq）与空间转录组学（ST），剖析肝脏肿瘤微环境（TME）与化疗耐药的互作。研究人员鉴定出一类以分泌磷蛋白1（SPP1）高表达为标志的巨噬细胞亚群，该亚群在NAC疗效不足者中显著富集。机制上，这些SPP1+巨噬细胞呈现促肿瘤转录特征，并通过SPP1?CD44信号轴直接抑制CD8+ T细胞毒功能，该结论由体外共培养、大规模组织芯片与多种同源小鼠模型证实。空间上，其散在分布于肿瘤内并形成致密屏障，隔离CD8+ T细胞并驱动其耗竭；该空间构型与细胞毒活性和适应性免疫特征呈负相关，从而强化局部免疫抑制生态位并维持化疗耐药。结果表明：有效化疗依赖免疫活跃的肝脏微环境，而SPP1+巨噬细胞浸润会破坏该状态并促进临床耐药。在临床前CRLM模型中，SPP1阻断与抗PD?1（anti?PD?1）协同，诱导显著瘤退并恢复T细胞功能。综上，该研究将SPP1+巨噬细胞定位为CRLM中NAC耐药的核心驱动者，并将其制造的空间免疫屏障作为克服化疗耐药和提升免疫治疗应答的潜力靶点。

研究背景方面，结直肠癌（CRC）是全球癌症死亡的主要原因之一，肝脏是最常见转移部位。对于结直肠癌肝转移（CRLM），以奥沙利铂为基础的新辅助化疗（NAC）可用于降期并增加根治性切除机会，但临床获益高度异质。肿瘤微环境（TME）是疗效关键决定因素，其中肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）可塑性强，常在TME中被“教育”为促肿瘤、M2样、促血管生成和免疫抑制表型。SPP1又称骨桥蛋白（osteopontin），是多功能的分泌型糖蛋白，参与免疫调控和组织重塑。已有研究提示SPP1⁺巨噬细胞在多种癌症中具有促肿瘤作用，但其在NAC处理后的CRLM微环境中的身份、功能、起源及其与化疗耐药的关系仍是黑箱。核心未解问题包括：SPP1⁺巨噬细胞是NAC耐药的主驱动还是旁观者；其通过何种分子机制 orchestrate 免疫抑制；在化疗选择压力下其发育起源是什么。该研究论文发表在《Molecular Biomedicine》。

主要关键技术方法方面，研究人员使用10例CRLM患者手术标本进行单细胞RNA测序（scRNA?seq），按病理反应分为good responders、poor responders、non?responders与untreated组；对部分患者配对开展10X Visium空间转录组（ST），用CytoSPACE将单细胞定义细胞类型映射到空间点位；用CellChat预测细胞间通信，用Squidpy做邻域富集分析，用scVelo做RNA速率轨迹推断；用组织芯片（TMA）和多重免疫荧光（mIHC）在人类标本中验证SPP1⁺CD68⁺巨噬细胞与CD8⁺ T细胞空间关系；用OT?1 CD8⁺ T细胞与SPP1过表达RAW264.7巨噬细胞共培养验证功能；体内采用CD45.1供体骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）过继转移联合MC38细胞脾内注射，以及MC38?SPP1?OE CRLM模型进行SPP1阻断联合抗PD?1（anti?PD?1）治疗实验；另用38例接受统一术后辅助化疗的CRLM回顾队列做免疫组化（IHC）生存验证。

研究结果方面，Neoadjuvant chemotherapy reshapes the immune microenvironment in CRLM：研究人员通过10例CRLM患者scRNA?seq获得99,694个细胞并注释18类主要细胞，发现non?responder与poor?responder组中巨噬细胞和成纤维细胞比例明显增加，提示疗效不足与更纤维化、免疫抑制微环境相关。

SPP1⁺ macrophages are a key feature distinguishing poor from good responders to NAC：研究人员比较poor与good responder巨噬细胞转录组，发现SPP1是上调最显著基因之一，且SPP1主要限定于一个巨噬细胞簇；GSVA显示该群富集上皮?间质转化（EMT）和血管生成，TLS特征低，ICB耐药评分高；RNA速率提示其由单核细胞向终末SPP1⁺巨噬细胞分化。

The SPP1?CD44 axis mediates the suppression of CD8⁺ T cell function：CellChat预测SPP1⁺巨噬细胞为优势发送者，SPP1?CD44为关键配受体对；体外OT?1 CD8⁺ T与SPP1?OE RAW264.7共培养后GZMB、TNFα下降；mIHC显示SPP1⁺巨噬细胞、CD44、CD8与CD68空间邻近，证明SPP1?CD44轴介导CD8⁺ T细胞功能抑制。

Spatial transcriptomics reveals the in situ architecture of the SPP1?driven immunosuppressive niche：ST显示疗效不足者肿瘤区SPP1⁺巨噬细胞更多、CD8⁺ T更少；邻域分析证实两者空间排斥；SPP1⁺巨噬细胞成簇将CD8⁺ T与肿瘤细胞物理分隔；SPP1与CD44在空间上共定位，SPP1相关通信在non/poor?responder中更强，并伴血管生成标志物升高与干扰素响应降低。

High SPP1 expression is a robust prognostic biomarker for poor outcomes in CRC：公共GEO队列中高SPP1关联更短无复发生存（RFS）与总生存（OS），且随病理分期升高；30例CRLM组织芯片中疗效不足者SPP1⁺CD68⁺巨噬细胞密度更高、CD8⁺ T更低；12例新鲜标本流式显示poor responder CD8⁺ T减少、Treg增多。

Macrophage?derived SPP1 is sufficient to drive tumor progression and immune suppression in vivo：研究人员将SPP1敲低BMDMs与MC38共注射入受体鼠，肿瘤负荷更低，瘤内CD8⁺ T的GZMB、IFNγ、TNFα增强，mIHC示Tim3降低，说明巨噬细胞来源SPP1足以促瘤并抑制免疫。

Dual blockade of SPP1 and PD?1 synergistically inhibits tumor growth and reinvigorates anti?tumor immunity：在MC38?SPP1?OE CRLM模型中，抗SPP1单药或抗PD?1单药仅中度控制，联合显著缩小肿瘤面积比至约13%，并提升CD8⁺ T浸润，表明SPP1阻断可解除巨噬细胞的物理与分子屏障，使免疫豁免肿瘤对检查点阻断敏感。

High SPP1 expression predicts early relapse in CRLM patients receiving post?operative chemotherapy：38例统一术后化疗CRLM队列IHC按中位评分分层，SPP1?high者RFS显著更短，HR=5.16，说明高SPP1关联辅助化疗后早期复发。

讨论部分总结方面，研究人员强调以poor与good responder比较能分离治疗适应期机制，而非仅捕获固有耐药；SPP1⁺巨噬细胞是疗效不足者的主要细胞差异因子，并在空间上形成隔离CD8⁺ T的屏障。SPP1?CD44被确立为TME关键检查点，但其他SPP1结合伙伴如整合素亦可能参与。转化上，SPP1⁺巨噬细胞密度或可成为NAC疗效预测标志物，SPP1阻断联合PD?1抑制具有明确临床前依据。局限性包括临床转录组数据为横断面、体内为实验性转移模型未完全模拟自发转移、SPP1?CD44下游AKT/NF?κB等信号未做生化阐明。

结论部分翻译：总之，这些发现确立SPP1⁺巨噬细胞为CRLM中NAC耐药的关键驱动者。poor与good responder的比较使研究人员能够解析耐药的适应性演化，而非仅捕获既有无应答。在此框架下，SPP1⁺巨噬细胞是通过SPP1?CD44轴排除并耗竭CD8⁺ T细胞、具免疫抑制和空间分隔TME的主动构建者。功能与空间证据将这些细胞定位为化疗耐药与免疫逃逸之间的机制桥梁。治疗性SPP1阻断与PD?1抑制协同重塑TME并恢复抗肿瘤免疫。这些临床前发现进一步得到独立术后化疗队列支持：高SPP1表达关联显著更短的无复发生存。该研究为患者的分层提供了机制基础，并支持在难治性CRLM中开展SPP1定向联合策略的临床评估。