脂质纳米载体工程化用于PROTAC递送：制备工艺与形态对药代动力学暴露的影响评估

《International Journal of Pharmaceutics》：Engineering lipid-based nanocarriers for PROTAC delivery: evaluating the influence of manufacturing and morphology on pharmacokinetic exposure

工程化脂质纳米载体用于PROTAC递送：评估制备工艺与形态对药代动力学暴露的影响 纳米颗粒尺寸对PROTAC药代动力学（PK）暴露的影响远大于颗粒形态。脂质纳米载体使G5472 PROTAC的暴露量实现了3.2倍的增加。酸性pH及G5472与二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）之间的相互作用驱动自组装形成平面脂质盘（lipodisks）。快速纳米沉淀（FNP）的混合动力学快于相分离动力学，从而将脂质体（liposomes）“捕获”在球形形态。约18.5 kcal/mol的解吸能垒为高载药量提供了原子层面的理论基础。

脂质纳米载体工程化用于PROTAC递送：制备工艺与形态对药代动力学暴露的影响——论文解读

一、研究背景与研究目的

在乳腺癌患者中，超过70%的患者表现出雌激素受体α（ERα）的过表达。抑制或降解该靶点可显著降低ERα依赖性癌细胞的增殖。已获批的治疗药物（如他莫昔芬、氟维司群）及临床候选药物（如GDC-0810）通过干扰ERα信号通路在抑制乳腺肿瘤生长方面展现出良好前景。蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）作为一种新兴的治疗模式，能够调控靶蛋白活性，与传统小分子抑制剂相比具有独特优势。本研究聚焦于Genentech临床前候选药物G5472——一种异源双功能PROTAC，由泛素连接酶结合子、ERα结合子及连接两者的连接链三个不同组分构成，通过形成三元复合物实现ERα的泛素化及蛋白酶体靶向降解。

PROTAC通常比传统小分子具有更大的分子量和更高的亲脂性，这些理化性质限制了药物溶解度并导致不良的生物物理特性，如低肠道通透性、低细胞通透性和高清除率。G5472是一种高亲脂性药物，水溶性差，静脉给药后迅速从体循环中清除。因此，识别能够增加全身暴露量的递送系统对于实现G5472的治疗效果至关重要。

脂质药物递送系统（LBDDS）已成为合成分子和生物药物非肠道递送的通用平台，其优势在于能够包封并保护治疗性药物免于血浆降解、通过降低清除率延长循环时间，并促进药物在靶组织中的蓄积。本研究系统探讨了不同制备条件下脂质颗粒形态和尺寸的变化，以及这些理化属性如何影响G5472在小鼠体内的清除率、循环时间和全身暴露量。据研究人员所知，这是首个全面比较不同制备技术生成不同LBDDS形态及其对PROTAC体内药代动力学行为影响的研究。

二、主要技术方法

研究人员采用三种制备技术工程化脂质纳米载体：快速纳米沉淀（FNP）、微流控混合（microfluidic mixing）以及薄膜水化结合挤出法（thin-film hydration with extrusion）。表征手段包括冷冻电子显微镜（Cryo-EM）用于形态学直接可视化、动态光散射（DLS）用于粒径及多分散指数测定、尺寸排阻色谱用于G5472包封率（%E）计算、Laurdan染料法用于膜流动性评估、差示扫描量热法（DSC）用于脂质-药物相互作用分析，以及全原子分子动力学（MD）模拟结合伞形采样用于计算G5472从脂质双层中拉出的自由能图谱。体内药代动力学研究在雌性CD-1小鼠中进行，单次静脉推注1 mg/kg G5472，采用非房室分析（NCA）计算药代动力学参数。

三、研究结果

3.1 脂质体和脂质盘的制备与表征

研究人员系统考察了不同制备条件对LBDDS形态的影响。当使用FNP制备不含药物的LBDDS时，无论采用何种水相条件，均观察到均一的脂质体群体。然而，在相同条件下加入G5472后，形态发生改变，出现脂质体和脂质盘的混合群体，表明G5472在颗粒形成过程中与脂质发生相互作用，影响脂质堆积和颗粒形态。

3.2 工艺条件对形态的影响

在醋酸盐缓冲液（pH 4.0）中，G5472被离子化并带正电荷，其溶解度提高至1.53 mg/mL。当药物与脂质比（D/L）为0.2时，主要观察到脂质盘（99%）。研究人员假设高浓度和带电荷的G5472增加了与特定脂质组分（如DSPC）的相互作用频率，驱动与PEG化脂质的相分离和脂质盘的形成。当使用FNP在PBS中制备时，脂质盘形成较少，但在低D/L（0.003）时主要形成脂质体（86%）且包封率高。微流控混合制备空LBDDS时观察到脂质体和脂质盘的混合群体，与FNP结果不同，这归因于两种混合技术的时间尺度差异：FNP的快速湍流混合在相分离和颗粒形成之前完成混合，从而形成脂质体；而微流控的较慢混合允许在达到平衡前有更长时间，允许脂质体和脂质盘共同形成。薄膜水化结合挤出法在两种缓冲液条件下均产生混合形态群体，这是首次在挤出过程中报道脂质盘的形成。

3.3 Laurdan染料法脂质堆积分析

Laurdan染料法显示，空脂质体的广义极化（GP）值为0.49，高于载G5472脂质体的0.37，表明G5472的加入使膜堆积更加不规则，证实了G5472-脂质相互作用的存在。

3.4 差示扫描量热法分析

DSC分析显示，空脂质盘在55°C处有一个宽的吸热转变，对应DSPC的凝胶-液晶相变。载G5472脂质盘则出现三个转变：约50°C的放热峰、55°C的吸热峰和71°C的小而尖锐的吸热峰。50°C的放热峰代表G5472与DSPC的缔合，71°C的高温峰归因于G5472的自相互作用。相比之下，载药和不载药脂质体在DSC上表现相似，均在53°C处显示单一尖锐吸热峰，表明脂质体中G5472与DSPC的相互作用显著较弱。将G5472添加到预先形成的空脂质盘中未观察到放热转变，支持G5472与DSPC的相互作用发生在脂质盘形成过程中而非表面吸附。

3.5 分子动力学模拟

全原子MD模拟结合伞形采样计算了将G5472从DSPC:胆固醇:PEG化脂质双层中拉出的自由能图谱。结果表明，膜中心是G5472的热力学偏好状态，自由能最小点在0 ?处。当G5472从疏水脂质双层中心被拉至外部水环境时，自由能单调急剧增加，最终自由能约为18.5 kcal/mol。自由能图谱在18 ?和30 ?处显示两个拐点，分别对应G5472通过两性离子脂质头基区域和水合PEG冠层。这一高解吸能垒为G5472在脂质体和脂质盘形成过程中稳定保留在脂质双层基质中提供了结构层面的理论依据。

3.6 优化制剂的理化表征

研究人员优化了三种用于体内研究的制剂：大脂质盘（微流控混合+醋酸盐缓冲液，87 nm）、大脂质体（FNP+PBS，90 nm）和小脂质盘（微流控混合+醋酸盐缓冲液+增加DSPE-PEG2000至20 mol%，36 nm）。三种制剂的包封率均超过97%。稳定性研究表明，大脂质盘和大脂质体在4°C储存一个月内保持物理稳定，而小脂质盘的多分散指数从0.18增加至0.58，表明粒径分布随时间变得不均匀。

3.7 溶解度、脂质相互作用与混合动力学对形态的机制性相互作用

脂质体与脂质盘形成的驱动力由热力学因素（pH依赖性药物溶解度和药物-脂质相互作用）与动力学因素（混合方法和时间尺度）之间的平衡决定。醋酸盐缓冲液使G5472离子化，溶解度比中性PBS提高数个数量级，并使G5472与DSPC磷酸头基之间能够发生电荷相互作用，增强G5472-DSPC亲和力。这些更强的相互作用诱导不规则脂质堆积并改变膜曲率，在能量上有利于PEG化脂质的相分离以形成脂质盘特有的平坦边缘。微流控混合的较慢混合时间尺度为G5472-DSPC复合物与DSPE-PEG2000发生相分离提供了时间，主要形成脂质盘群体。FNP的快速湍流混合时间尺度快于相分离动力学，即使在醋酸盐缓冲液中也将脂质“捕获”在标准球形脂质体形态。

3.8 药代动力学结果与讨论

体内研究在CD-1小鼠中进行，静脉给予1 mg/kg G5472。游离G5472溶液制剂在给药后迅速消除，3小时后浓度低于检测限。大脂质体和大脂质盘制剂使G5472血浆暴露量增加约3倍，而小脂质盘未显示显著增强。非房室分析显示，脂质体和大脂质盘制剂使表观血浆半衰期（t_1/2）分别延长约8倍和6倍，表观清除率（CL）分别降低约3.5倍和3.0倍。小脂质盘对表观清除率和半衰期无显著影响。G5472与DSPC的浓度比分析显示，小脂质盘中G5472释放更快且清除更迅速，而大颗粒制剂在血浆中保持G5472与DSPC的共定位更长时间。总体而言，颗粒尺寸对表观药代动力学参数的影响远大于形态。

四、结论与讨论

研究人员通过三种不同技术制备了具有可控尺寸和形态的含或不含G5472的LBDDS，发现制备技术——包括混合方法、水相溶液组成及G5472的存在——在控制LBDDS形态中发挥重要作用。微流控混合、酸性缓冲液条件和G5472的掺入对脂质盘形成至关重要，其驱动力源于G5472-DSPC相互作用。正交表征技术的联合应用对于理解形态、包封和脂质堆积之间的关系至关重要。G5472对脂质堆积和形态影响的有趣结果提示了基于药物-脂质相互作用优化的脂质盘生成新方法。

体内评价表明，颗粒尺寸对表观药代动力学参数的影响大于形态。大脂质盘和大脂质体（水动力直径80-90 nm）相比小脂质盘（34 nm）和溶液制剂，改善了G5472血浆暴露量，降低了表观血浆清除率，延长了表观半衰期。这些结果证实LBDDS可用于成功增加自身快速清除的PROTAC的暴露量。大脂质体和脂质盘实现的延长全身暴露和降低表观清除率使其充当G5472的循环储库，可缓慢释放药物至血浆。然而，增加的血浆暴露量可能不直接转化为增强的活性或降低PROTAC剂量的能力，因为活性需要分布、细胞内运输以及靶点参与和降解。未来研究应在相关小鼠异种移植模型中评估血浆、组织和肿瘤中的药代动力学，并纳入药效学和疗效读数。此外，需要进一步研究形态是否影响生物分布，以及增加的暴露量是否导致增强的疗效。值得注意的是，DSC观察到的脂质盘样品中G5472与DSPC的更强相互作用并未转化为体内LBDDS中更强的药物保留，提示修饰脂质或药物结构可能是进一步调节脂质-药物相互作用强度并可能改善体内给药后药物保留的有趣途径。