《Advanced Healthcare Materials》：Advances in 3D Bioprinting for Breast Cancer Modeling: Tumor Microenvironment, Metastasis, and Drug Screening
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肿瘤微环境（TME）是一个复杂的异质性场所，包含生物学和生化事件，以及肿瘤细胞与基质细胞之间多样的物理、化学和力学相互作用。这种异质性在调控肿瘤进展、转移和治疗耐药中起着关键作用。在乳腺癌中，癌症相关成纤维细胞、脂肪细胞、内皮细胞和免疫细胞均参与
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肿瘤微环境（TME）是一个复杂的异质性场所，包含生物学和生化事件，以及肿瘤细胞与基质细胞之间多样的物理、化学和力学相互作用。这种异质性在调控肿瘤进展、转移和治疗耐药中起着关键作用。在乳腺癌中，癌症相关成纤维细胞、脂肪细胞、内皮细胞和免疫细胞均参与构成这一复杂环境，因此需要精确的空间和细胞建模以更好地模拟生理条件。此外，血管生成和转移是导致乳腺癌死亡的关键因素。因此，整合了癌细胞与基质细胞共培养的三维（3D）模型对于重建真实的TME至关重要。本综述重点介绍了用于乳腺癌TME建模的三维生物打印（3DBP）技术的最新进展。研究人员讨论了其在药物筛选中的潜力，探讨了其优势与局限性，并概述了未来提升其保真度和转化相关性的方向。
论文主体内容专业总结
1 引言
乳腺癌是全球女性中第二常见的癌症，2022年全球新增230万例病例和67万例死亡。预计到2050年，新发病例和相关死亡率将分别上升38%和68%。治疗策略取决于肿瘤分期、分子亚型（如激素受体状态）和患者特异性因素，包括手术、放疗和全身治疗。尽管已证明药物类型和敏感性存在差异，并且已开发出单克隆抗体等靶向疗法，但大多数临床前研究仍依赖传统的二维（2D）细胞培养或动物模型，这些模型无法重现复杂的人类TME。
2D培养虽然成本低廉且应用广泛，但缺乏TME的关键组分，如细胞外基质（ECM）、基质相互作用和力学信号。此外，2D细胞培养无法模拟细胞间的相互作用和肿瘤的天然结构，而这些对细胞分化、增殖、迁移、基因表达、蛋白质产生、酶促药物代谢及其他重要细胞功能至关重要。这些缺陷削弱了其在药物筛选中的预测价值，导致抗癌药物在临床试验中的高失败率。长期2D培养还常导致形态改变、表型漂移，以及缺乏体内肿瘤典型的营养和代谢物梯度。
Transwell模型已被开发出来，允许通过多孔聚合物膜有限地研究癌细胞的迁移和侵袭。在迁移实验中，癌细胞被接种在多孔膜插件上，可测量细胞通过膜孔的易位。侵袭实验相对复杂：多孔聚合物膜覆盖一层ECM，测量细胞穿过ECM的迁移。虽然这些模型有助于研究转移的特定方面，但它们无法捕捉实体瘤的细胞和结构复杂性。
动物模型已被开发用于重现肿瘤病理生理学，包括患者来源的异种移植模型（PDX），其提供了更真实的三维（3D）环境。然而，物种特异性的生理差异限制了其转化准确性，伦理和成本考量也使其使用更加复杂。因此，迫切需要更具生理相关性和人类相关性的模型。
乳腺癌TME由多种多样的肿瘤细胞和基质细胞组成：成纤维细胞、脂肪细胞、内皮细胞、免疫细胞和间充质干细胞（MSCs），它们嵌入在复杂的ECM中。这种动态的微环境不仅支持肿瘤生长，还通过生化信号和力学相互作用促进治疗耐药和转移扩散。理解TME的复杂性对于开发合适的模型以及推进药物开发和个性化癌症治疗至关重要。
因此，3D微生理体外系统的开发开启了新的可能性，因为这类系统更能代表体内的3D结构。这些模型通过使用患者来源的细胞实现了个体化方法的开发，可能改善治疗预测。改进且准确的模型和筛选工具将通过早期淘汰不良候选药物，加速有效抗癌疗法的转化，节省数十亿美元，并将精力集中在选定的候选药物上以推向市场。
在3D微生理体外系统中，三维生物打印（3DBP）已成为构建乳腺癌多细胞模型的强大平台。3DBP通过将癌细胞与各种支持细胞类型（包括成纤维细胞、脂肪细胞、内皮细胞和免疫细胞）结合，能够重现TME的复杂性，从而增强模型的生理相关性。
近期研究利用3DBP通过共培养癌细胞与以下细胞来重建乳腺癌多细胞TME：（1）一种其他细胞类型，如正常上皮细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、干细胞或淋巴管内皮细胞（LECs）；（2）两种其他细胞类型，如成纤维细胞和内皮细胞、干细胞和内皮细胞，或成纤维细胞和单个核细胞；（3）三种其他细胞类型（成纤维细胞、干细胞和内皮细胞），进一步增加了TME的复杂性。此外，还开发了先进的3DBP乳腺癌TME模型，使用了：（1）预形成的球状体，包括仅含乳腺癌细胞的球状体，以及与成纤维细胞、成纤维细胞和内皮细胞、MSCs和内皮细胞，或与正常上皮细胞、MSCs和内皮细胞结合的球状体；（2）预形成球状体与单个细胞（一种或两种细胞类型）的组合；（3）预形成的类器官；（4）3DBP与微流控技术的结合。
近期工作日益表明，乳腺癌3DBP建模正从静态的、基于细胞系的构建体，转向保留肿瘤异质性的患者来源或类器官驱动的系统、动态灌注模型，以及耦合血管和免疫区室的平台，以更好地再现运输、细胞运输和治疗反应。与此同时，自动化多孔生物打印和高内涵读数正在实现可扩展的高通量药物筛选，而人工智能和机器学习辅助的图像及数据分析正在涌现用于响应量化，尽管AI与生物打印肿瘤模型的直接集成仍然有限。这些人类相关平台越来越符合新方法学（NAMs）；然而，它们的监管验证和临床转化将需要标准化的材料和制造方案、定量性能基准、实验室间可重复性，以及针对匹配的患者样本和临床反应的按需验证。
尽管取得了进展，先前的综述仅部分涉及了这些发展。现有综述通常涵盖应用于乳腺组织的生物工程方法和乳腺癌模型；然而，3DBP方法仅是其中的一部分。针对3D打印癌症模型或3DBP再生应用的综述对乳腺癌建模中3DBP特有的进展关注有限。关于乳腺癌3DBP的两篇主要综述（发表于2018年和2021年）简要讨论了3DBP，并未全面分析生物打印策略的最新进展。第一篇综述主要涵盖TME和组织工程，仅部分涉及3DBP，描述了用于乳腺癌的3DBP技术和材料，尤其是在药学研究方面。第二篇综述是关于“工程化乳腺癌微环境和3DBP”。这两篇综述都缺乏对乳腺癌3DBP的关注，以及对乳腺癌3DBP模型在模拟TME和复杂性方面演变的深入分析。自2018年和2021年这些综述发表以来，该领域已取得进展。
为了弥补这一知识空白，本综述专门聚焦于基于3DBP的乳腺癌模型，强调：（1）生物打印模型从简单的单细胞类型培养到复杂的多细胞类型、血管化系统的演变；（2）使用预形成球状体、预形成类器官和微流控集成；（3）在转移研究、血管和淋巴管建模以及药物筛选中的应用。
2 乳腺癌3DBP建模概述
乳腺癌建模的目标是尽可能准确地重现肿瘤和TME。为此，采用3DBP来控制工程化组织构建体中细胞的位置，允许多种细胞类型的使用，并创建模拟血液和淋巴管的通道，以及整合免疫细胞。此外，它还被用于开发转移模型和利用趋化因子梯度的模型。它为研究正常条件下的肿瘤细胞行为提供了机会。为实现这一目标，使用了各种生物材料来包裹肿瘤和其他细胞类型，并尽可能模拟肿瘤ECM在力学特性方面的性质，允许扩散、侵袭和转移。
2.1 使用的细胞
最常见的乳腺癌是癌，通常是腺癌，起源于乳腺导管或小叶。在所有乳腺癌诊断中，浸润性导管癌占80%。尽管三阴性乳腺癌仅占所有乳腺癌的约15%，但它是一种侵袭性强的浸润性乳腺癌，难以治疗。三阴性乳腺癌细胞不表达雌激素或孕激素受体（ER或PR），且表达少量或不表达HER2。因此，三阴性浸润性导管癌细胞系（如MDA-MB-231、MDA-MB-468）已被用于3DBP模型中。
70%-80%的乳腺癌为ER阳性。ER在癌细胞的增殖、存活和侵袭中发挥重要作用，并为治疗提供了靶点。激素受体阳性（HR+）/HER2阴性乳腺癌已成为一个临床挑战，针对此类癌症，周期蛋白依赖性激酶4和6（CDK4/6）抑制剂联合内分泌治疗的组合疗法正成为一线和二线治疗的标准选择。诸如ZR-75-1等细胞系（ER+、PR+、HER2低表达）可能有用，尽管迄今为止它们在3DBP模型中尚未得到广泛应用。到目前为止，乳腺癌3DBP研究最常涉及使用导管癌细胞系，即MCF-7和MDA-MB-231。也使用了SK-BR-3、MDA-MB-468和4T1等细胞系。其中一些细胞系被用于制备用于生物墨水的球状体，包括源自MDA-MB-231、MCF-7、MCF-10A和MCF-10AT的球状体。
大多数研究使用细胞系，因为它们易于处理、具有无限自我复制能力和相对较高的同质性。原代细胞虽然更具肿瘤代表性，但寿命有限且存在异质性。然而，在使用这些模型开发个性化医疗时，应使用原代细胞。
2.2 使用的生物墨水材料
用于乳腺癌3DBP的水凝胶主要是海藻酸盐或含海藻酸盐的材料。后者主要包括海藻酸盐和明胶的组合。这是因为海藻酸盐是一种生物相容性好的惰性材料。明胶提供弹性和细胞粘附位点。此外，海藻酸盐/明胶还与其它成分结合使用，例如与Matrigel联用，后者含有基底膜大分子，有助于球状体生成。用于乳腺癌3DBP的其他水凝胶包括基于明胶的材料，如甲基丙烯酰化明胶（GelMA）。明胶为细胞附着和增殖提供了良好的环境。脱细胞ECM及其衍生物也被用于更好地模拟TME。生物墨水成分强烈影响3DBP乳腺癌模型中的肿瘤行为和药物反应。乳腺肿瘤通常表现出高于4 kPa的硬度，在高度纤维化区域可能达到约42 kPa；因此，中等硬度的生物墨水（约3-20 kPa）可以改善生理相关性和形状保真度，而过高的硬度通常与更高的粘度、交联密度和更小的孔径相关，可能会增加挤出诱导的细胞损伤，限制迁移并减少药物扩散。降解性也必须平衡，以允许ECM重塑、增殖、侵袭和长期培养，同时保持构建体完整性：胶原蛋白、明胶、GelMA和dECM易受基质金属蛋白酶介导的降解，而海藻酸盐则不然，透明质酸主要由透明质酸酶降解。孔隙率和互连性控制着氧气、营养物质、废物和药物的传输，同时也影响细胞受限和侵袭。粘附配体的呈递进一步调节整合素信号传导、存活、迁移、干性和治疗敏感性，明胶、胶原蛋白、Matrigel和dECM比海藻酸盐或聚乙二醇提供更多生物活性信号。然而，Matrigel和dECM未定义的成分和批次变异性会改变硬度、配体密度、降解和生长因子含量，降低可重复性。最后，交联化学决定硬度、孔径、溶胀、稳定性、配体可及性和降解性；过度交联会损害重塑和药物渗透，而交联不足则会损害结构保真度。
