《Journal of Genetics and Genomics》：Plant-mediated RNAi via
Panonychus citri-derived miRNAs disrupts adult emergence and confers mite resistance
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摘要微小RNA（miRNAs）是触发RNA干扰（RNAi）的小型非编码RNA，是害虫防治的有前景候选分子，但其对非昆虫类害虫的效力尚缺乏充分研究。本研究评估了螨虫来源的内源性miRNA作为转基因用于作物抗柑橘全爪螨（Panonychus citri）的潜力，该螨虫是一种抗性发
摘要
微小RNA（miRNAs）是触发RNA干扰（RNAi）的小型非编码RNA，是害虫防治的有前景候选分子，但其对非昆虫类害虫的效力尚缺乏充分研究。本研究评估了螨虫来源的内源性miRNA作为转基因用于作物抗柑橘全爪螨（Panonychus citri）的潜力，该螨虫是一种抗性发展迅速、对柑橘、大豆及其他经济作物造成严重损害的主要害虫。通过对P. citri发育期miRNA文库的分析，我们鉴定出miR-750和miR-200a-5p是变形若虫向成虫转变过程中的关键调控因子，其过表达显著抑制了成虫羽化。体内和体外实验均证实，miR-750靶向NFYB和ADRM1，而miR-200a-5p特异性靶向ADRM1；通过dsRNA介导的沉默这两个基因可重现miRNA过表达所诱导的羽化缺陷。我们构建了单拷贝转基因大豆品系，其中品系7#6高表达miR-750，品系2#14高表达miR-200a-5p。利用T1代进行的离体叶片和整株生物测定显示，两个品系均表现出对P. citri的强抗性。值得注意的是，两个转基因品系均不对非靶标捕食螨巴克新点螨（Neoseiulus barkeri）产生不利影响，无论是通过直接miRNA暴露还是猎物介导的转移途径。对P. citri的抗性及对N. barkeri的生物安全性在T2代中得以保持。这些发现凸显了内源性miRNA作为开发生态友好型可持续害虫管理策略有效靶标的潜力。
引言
柑橘和大豆是全球重要的经济作物，其全球需求不断增长（van Dijk等，2021；Dubey等，2023）。然而，它们的生长和产量受到柑橘全爪螨（Panonychus citri）的严重威胁，这是一种典型的r-对策型害虫螨虫（Van Leeuwen等，2011），具有种群快速增长的能力和对杀螨剂的高抗性发展倾向。因此，对P. citri的化学防治越来越无效（Pan等，2020），突显了开发针对该害虫螨虫的高效环保防治策略的紧迫性。
RNA干扰（RNAi），又称双链RNA（dsRNA）诱导的转录后基因沉默，是一种保守的细胞机制，由名为Argonaute（Ago）的RNA结合蛋白家族调控（Fire等，1998；Zhou等，2008）。RNAi已成为昆虫功能基因组学中的有力工具，在害虫管理方面具有重大前景（Zhou等，2008；Feng等，2023）。迄今为止，已开发出三种主要的外源dsRNA递送策略用于基于RNAi的杀虫应用：(1) 外源产生dsRNA的转基因作物；(2) 叶面施用的dsRNA制剂（Narva等，2025）；(3) 表达dsRNA的基因工程致病细菌（Xue等，2023）。
表达dsRNA的转基因植物标志着向实际应用迈出的第一步。2017年，美国环境保护署（US EPA）批准了RNAi技术用于商业昆虫防治的首个应用：以SmartStax? PRO品牌上市的MON 87411玉米（Head等，2017）。该玉米通过表达Snf7特异性dsRNA结合Bt杀虫蛋白（Gpp34Aa/Tpp35Aa），实现了对西方根瘤象（WCR，Diabrotica virgifera virgifera）的冗余控制。其他RNAi转基因作物也表现出对各种昆虫的抗性，包括斜纹夜蛾（Spodoptera littoralis）（Di Lelio等，2022）、迁飞蝗（Locusta migratoria）（Zheng等，2025）、禾谷缢管蚜（Sitobion miscanthi）（Zhang等，2021b）、桃蚜和烟粉虱（Myzus persicae和Bemisia tabaci）（Dong等，2024）以及棉铃虫（Heliothis armigera）（Tian等，2015）。可喷施的dsRNA制剂也已开发出来。2023年，US EPA批准了以Calantha?品牌上市的Ledprona，这是首个靶向科罗拉多马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）的可喷施dsRNA生物杀虫剂（Rodrigues等，2021）。将表达dsPxAK的基因工程Bt菌株8010AKi/BMB171AKi与Bt 8010联合使用，相比单独使用Bt 8010，害虫死亡率显著更高（Jiang等，2022）。这一可行的策略将昆虫病原菌与RNAi相结合，用于害虫综合治理。
然而，可喷施的dsRNA在环境中降解迅速（Bachman等，2020），外源杀虫dsRNA产品的密集施用已导致害虫对dsRNA产生抗性。例如，经过田间暴露和后续实验室选择后，DvSnf7 dsRNA抗性的西方根瘤象幼虫种群表现出≥130倍的抗性（Khajuria等，2018）。类似地，在叶面施用非转基因dsRNA后，L. decemlineata经过9代选择后表现出>11,100倍的dsRNA抗性（Mishra等，2021），而多色扁龟甲（Plagiodera versicolora）经过7代选择后表现出>4,110倍的抗性（Liao等，2024）。这些抗性种群还表现出对多种dsRNA的交叉抗性，表明这一现象可能会限制基于dsRNA的替代策略的效用并增加相关应用成本。
鉴于基于dsRNA的策略固有的局限性，内源性miRNA已成为调控害虫多种生物过程（包括发育、繁殖、变态、免疫和杀虫剂抗性）的有效替代方案（Belles，2017；Zhang等，2021a）。与dsRNA不同，miRNA经过不同的生物合成途径，利用细胞转运机制，并以靶标特异性的方式发挥作用，凸显了其作为害虫防治策略的潜力。例如，miR-34-5p是一种高度保守的鳞翅目miRNA，靶向EcR，通过注射或饲喂方式过表达或敲低时，可导致鳞翅目害虫大量死亡（Li等，2023）。表达pxy-miR-34-5p的基因工程拟南芥（Arabidopsis thaliana）和芸薹属芸薹（Brassica campestris）可在多种鳞翅目害虫中诱导高死亡率和严重发育缺陷（Li等，2024b）。其他转基因miRNA作物也表现出对各种害虫的活性，包括迁飞蝗（L. migratoria）（Yang等，2022）、桃蚜和豌豆蚜（M. persicae和Acyrthosiphon pisum）（Shang等，2024）、二化螟（Chilo suppressalis）（He等，2019）以及棉铃虫（H. armigera）（Bally等，2020）。
转基因miRNA作物因其固有的杀虫特性，为基于dsRNA的杀虫产品提供了替代方案。抑制害虫螨虫发育为成虫可以有效抑制其种群增长。因此，本研究聚焦于害虫螨虫从变形若虫向成虫的转变。在我们之前的研究中，我们构建了覆盖P. citri不同发育阶段的miRNA文库（Li等，2024a）。我们进一步分析了该文库，以鉴定在变形若虫向成虫发育转变过程中差异表达的miRNA。本研究解决了三个核心问题：(1) 这些miRNA在P. citri羽化过程中的调控作用；(2) 表达这些miRNA的转基因大豆对P. citri的效力；(3) 转基因miRNA大豆对非靶标天敌的影响。基于我们的发现，我们提出了一种害虫螨虫绿色管理的有前景的策略。
章节摘要
关键miRNA调控P. citri的羽化
变形若虫需要约48小时（h）才能蜕变为成虫：螨虫在前24小时内积极取食，随后在接下来的24小时内进入静息状态。在此发育阶段检测到miR-200a-5p和miR-750显著上调（图1A）。尽管这两种miRNA在变形若虫阶段2小时至26小时之间表达下调，但它们的表达在45小时即成虫羽化前急剧增加（图S1C）。综合而言，这些结果表明
讨论
在本研究中，两种miRNA——miR-200a-5p和miR-750——被鉴定为P. citri羽化过程的关键调控因子。通过双荧光素酶报告基因实验和RNAi实验进一步阐明了其分子调控机制，证实miR-750靶向NFYB和ADRM1，而miR-200a-5p靶向ADRM1。随后，成功构建了两个转基因miRNA大豆品系，结果表明这些转基因大豆对
昆虫饲养
P. citri最初采集自中国农业科学院柑橘研究所（中国重庆），在新鲜大豆（Glycine max (L.) Merr.）叶片上饲养，温度为27°C ± 1°C，相对湿度60% ± 10%，光周期为14小时光照/10小时黑暗，方法如前所述（Li等，2024a）。为确保龄期一致，所有害虫螨虫均来源于单一批次卵，并在相同环境条件下于收获的大豆叶片上饲养，直至其用于实验
数据可用性
本研究中产生或分析的所有数据均包含在正文和补充材料中。支持本研究结论的其他数据可向通讯作者提出合理请求后获取。
CRediT作者贡献声明
李传震：概念化、调查、数据整理、方法学、验证、可视化、撰写——初稿。李钰昌和张静瑶：调查、验证。李博依和夏梦豪：方法学、验证、可视化。王金军和窦伟：概念化、项目管理、撰写——审阅与编辑。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（32272525）、重庆市自然科学基金项目（CSTB2025NSCQ-GPX0481，CSTB2025NSCQ-LZX0031）和国家现代农业产业技术体系（CARS-24）的资助。
李传震|李钰昌|张静瑶|李博依|夏梦豪|王金军|窦伟
