接受体外受精治疗的卵巢反应正常和卵巢反应不良患者中细胞凋亡标志物（TNF-α和GABRA-1）、相关非编码RNA及促炎细胞因子（白介素-6）的分析

《Journal of Gynecology Obstetrics and Human Reproduction》：Analysis of cell apoptosis makers ( TNF-α and GABRA-1), related non-coding RNAs and pro-inflammatory cytokine (Interleukin-6) in patients with normal and poor ovarian response undergoing in vitro fertilization

**摘要**

**目的** 本研究主要旨在评估参与卵巢刺激和体外受精（OS/IVF）项目的正常卵巢反应（NOR）和卵巢反应不良（POR）女性中，从生物样本（血液血浆、卵泡液和 cumulus 细胞）中获得的细胞凋亡标志物（TNF-α和GABRA-1 mRNA）的表达水平、相关非编码RNA（miRNA-181和miRNA-139）以及促炎细胞因子（白介素-6；IL-6）的浓度。

**方法** 共有35名符合纳入标准的参与者被招募：NOR组=20名参与者，POR组（根据博洛尼亚标准）=15名参与者。分别使用定量聚合酶链反应和 sandwich 酶联免疫吸附测定法评估细胞凋亡基因（mRNA）、miRNA的表达水平和IL-6的浓度。

**结果** 主要发现显示，在所选生物标志物中，POR患者 cumulus 细胞中TNF-α mRNA的表达水平显著升高。此外，该生物标志物还与抗苗勒管激素水平、窦卵泡计数、取卵数量以及miRNA-181的表达水平显著相关（P < 0.05）。

**结论** 我们的发现强调，cumulus 细胞中TNF-α和miRNA-181的表达水平可能为OS/IVF过程中卵巢反应不良相关的细胞凋亡机制提供新的见解。

**引言**

世界卫生组织将不孕症认定为主要公共卫生问题，其影响正日益波及全球育龄夫妇[1]。卵巢刺激（OS）和体外受精（IVF）被认为是应对这一挑战的主要辅助生殖技术。尽管IVF取得了进展，但被称为"卵巢反应不良者"（POR）的患者亚群仍表现出次优的治疗结局。根据欧洲人类生殖与胚胎学会（ESHRE）共识的定义，POR患者在常规卵巢刺激方案下的反应通常不如正常卵巢反应（NOR）患者[2]。这一现象导致募集的卵泡和获取的卵母细胞数量减少，通常导致IVF结局较差[2]。此外，ESHRE共识指出，与POR发病机制相关的危险因素涉及多种因素，包括遗传性和获得性疾病[2]。突变、特定基因变异和染色体异常可能导致卵巢储备和反应降低[2,3]。然而，这些因素中的每一个都存在一定的局限性，阻碍了对POR发病机制的完全理解[4,5]。因此，有必要对POR患者中新候选基因的功能进行深入调查。所提出的发现可能为更好地理解相关危险因素提供基础知识，旨在开发个性化治疗策略。

细胞凋亡是一种固有的过程，通过发育和衰老过程中的受控细胞死亡来调节组织稳态[6]。在卵巢内环境中，每个月经周期的卵泡募集通过凋亡信号和生存信号之间的交叉对话进行精确调控。通常，仅有一个优势卵泡被选中进行排卵，而其余卵泡发生退化或闭锁[7]。基本上，几类内在因子可触发细胞凋亡，包括促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）。编码TNF-α的TNF-α基因被认为通过多种内在途径在多种哺乳动物物种中的细胞增殖和凋亡中发挥关键作用，其中包括由非编码RNA（特别是microRNA（miRNA-181））介导的途径[8,9]。对于miRNA-181，这种microRNA加剧了TNF-α介导的线粒体变化。将miRNA-181转染到小鼠肉瘤细胞中导致线粒体膜电位进一步降低[9]。这一发现强调了TNF-α诱导的线粒体失调增强。此外，该研究证实了先前的研究，即TNF-α在不同细胞类型中引起线粒体膜去极化和线粒体膜电位丧失，包括小鼠成纤维细胞[10]。根据卵巢生物学，先前在一项新生儿大鼠研究中，研究了外源性TNF-α蛋白对半卵巢体外培养期间完整 follicle 数量的影响[11]。结果显示TNF-α补充升高了 follicle 中凋亡DNA的比率[11]。此外，一项针对健康女性和多囊卵巢综合征患者的研究表明，高剂量外源性TNF-α蛋白在体外培养后阻碍了颗粒细胞活力和抑制素B的分泌[12]。相反，细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子对TNF-α mRNA表达的下调防止了大鼠卵泡发生闭锁和凋亡，突出了TNF-α基因和蛋白在卵泡发育中的重要作用[13]。

除了其调节细胞凋亡的直接作用外，TNF-α可以通过JAK/STAT3信号通路诱导白介素-6（IL-6）的合成，这是一种在炎症方面具有多种效应的可溶性介质[14,15]。先前的研究表明，卵泡液中IL-6浓度升高与慢性炎症和次优的IVF结局相关，特别是在POR患者中[16]。这表明，凋亡失调以及卵母细胞周围的局部炎症环境可能是这些个体生殖潜力降低的关键因素。

除了TNF-α外，γ-氨基丁酸A受体1（GABRA-1）是与细胞凋亡相关的重要内在因子之一[17]。GABRA-1基因和蛋白的主要功能是抑制细胞凋亡和促进细胞增殖[17]。在胶质瘤中观察到GABRA-1 mRNA表达升高，而其对下游的影响由miRNA（miRNA-139和miRNA-155）在转录后水平进行调控[17,18]。对于miRNA-139，这种非编码RNA已被认定为肿瘤抑制因子，可调节癌症进展[18]。其机制涉及通过凋亡相关途径进行调控[18]。miRNA-139的表达在多种癌症类型中下调，包括前列腺癌、胰腺癌和非小细胞肺癌[18]。鉴于miRNA-139对GABRA-1的已记录调控作用，因此在本研究中选择了miRNA-139以进一步调查其与OS和IVF过程中卵巢反应相关凋亡分子机制的潜在关联。此外，最近的研究表明，GABRA-1基因可检测出不孕患者（包括NOR和POR患者）血液血浆中的存在，表明GABRA-1基因和蛋白与卵泡发育相关[19]。

细胞凋亡标志物、其相关非编码RNA以及促炎细胞因子之间的相互作用代表了一个复杂但有前景的研究领域，特别是在IVF治疗过程中卵巢反应的背景下。通过比较POR患者与NOR患者，可能能够鉴定出区分这些分组的分子特征，从而有望开发新的诊断生物标志物。因此，本研究旨在评估来自接受IVF治疗的NOR和POR患者的生物样本（血液血浆、卵泡液和 cumulus 细胞）中细胞凋亡标志物（TNF-α和GABRA-1 mRNA）的表达水平、其相关miRNA（miRNA-181和miRNA-139）以及IL-6浓度。

**章节片段**

**伦理批准**

本研究为横断面研究，已获泰国曼谷朱拉隆功医学院机构审查委员会批准（IRB No. 905/64）。已获取所有参与者的书面知情同意书。

**参与者**

共初步招募了40名年龄在30-42岁之间、在泰国朱拉隆功国王纪念医院生殖生物学单元和不孕症诊所接受OS和IVF的不孕女性，招募时间为2022年3月至2022年12月。参与者的招募基于……

**人口统计数据、卵巢刺激和体外受精（IVF）结局**

所有参与者的人口统计数据见表2。大多数参与者被归类为正常BMI，并被诊断为原发性不孕。POR组中的大多数患者年龄在40岁以下，并根据既往POR病史和异常卵巢储备检测符合博洛尼亚标准。在POR参与者中，AFC和AMH水平均低于NOR参与者（P < 0.001）。然而，其他基线激素谱（FSH……

**讨论**

本研究检查了在OS和IVF项目中接受治疗的具有NOR和POR的不孕患者从不同生物样本中获得的细胞凋亡基因（TNF-α和GABRA-1）、相关miRNA（miRNA-181和miRNA-139）以及促炎细胞因子（IL-6）浓度的表达水平。我们的主要发现显示，在潜在生物标志物中，POR患者 cumulus 细胞中TNF-α mRNA的表达水平显著升高。此外……

**结论**

这是第一项研究两个候选凋亡基因（TNF-α和GABRA-1）及其相关非编码RNA（miRNA-181和miRNA-139）的研究，据推测这些基因与促炎细胞因子（IL-6）和OS/IVF过程中的卵巢反应相关。由于GABRA-1、miRNA-139和IL-6水平在不同患者组之间没有差异，我们的结果强调，cumulus 细胞中TNF-α和miRNA-181的表达水平可能为凋亡相关机制提供新证据……

**伦理声明**

已获取所有参与者或其法定代表人的书面知情同意，同意参与本研究并发表文章。已尊重参与者的隐私权。本研究包含器官或组织捐赠者。本研究包括人类生物材料，捐赠者或其近亲或法定代表人已同意用于本研究及发表文章。本研究使用的样本来源并非……

**利益冲突声明**

作者没有需要披露的相关财务或非财务利益。

**生成式AI在科学写作中的使用声明**

作者在准备稿件期间使用Grammarly程序纠正语法和拼写。

**资助**

本研究由泰国高等教育科学、研究与创新政策委员会人力资源管理及制度发展、研究与创新项目管理单位（PMU-B）提供资金资助。

**作者贡献**

P Sirayapiwat和P Thuwanut提供了研究概念和设计。

P Sirayapiwat和W Sereepapong收集了生物样本。

K Ruangprachum和P Thuwanut进行了研究实验、临床数据收集、分析和解释。

P Thuwanut最初撰写了稿件草稿。

P Sirayapiwat进行了修改并提供批注。稿件草稿经所有作者批准。

**补充表1.** 各候选生物标志物与其他选定因素之间的相关性

**利益冲突声明**

作者没有需要披露的相关财务或非财务利益。

**致谢**

作者衷心感谢所有参与者、生殖生物学单元工作人员（医学研究员、护士、护士助理和胚胎学家）收集生物样本。

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