时空转录组与单细胞转录组分析揭示胆管炎症中CD226-NECTIN2介导的T细胞-胆管细胞相互作用

《Journal of Hepatology》：Temporal assessment of spatial and single-cell transcriptomes identifies CD226-NECTIN2 T cell-cholangiocyte interaction in bile duct inflammation

• 空间转录组学（spatial transcriptomics）与单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）区分了NOD.c3c4小鼠肝脏中的炎症区域与非炎症区域，揭示以胆管为中心的免疫浸润。
• 研究人员鉴定出T细胞上的Cd226与胆管细胞上的Nectin2之间的相互作用是胆管炎症的潜在驱动因素。
• 敲低（knock-down）胆管细胞上的NECTIN2导致脾细胞（splenocyte）活化降低。
• 在NOD.c3c4小鼠中进行CD226的体内抗体阻断导致早期T细胞表型改变。
• CD226-NECTIN2相互作用在人原发性硬化性胆管炎（primary sclerosing cholangitis, PSC）肝脏样本中富集，提示其在PSC发病机制中的相关性。

论文解读：时空转录组与单细胞转录组解析胆管炎症中CD226-NECTIN2 T细胞-胆管细胞相互作用

研究背景与问题：炎症性胆管疾病可影响儿童和成人，通常呈慢性和进行性病程。目前治疗选择有限，慢性炎症常导致肝硬化，需要肝移植（liver transplantation, LTX）或早期死亡。在成人中，原发性硬化性胆管炎（primary sclerosing cholangitis, PSC）和原发性胆汁性胆管炎（primary biliary cholangitis, PBC）是最常见的免疫介导胆汁淤积性疾病，发病率增加。PSC与PBC进展缓慢，特征为胆管炎症和胆管细胞破坏，PBC主要影响小胆管，PSC影响中大胆管。PSC强人类白细胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）关联提示适应性免疫参与；PBC有环境及遗传因素，对线粒体抗原耐受丧失导致抗线粒体抗体（anti-mitochondrial antibodies, AMAs）。两者中胆管细胞不确定激活，增殖并分泌促炎、促纤维介质。PBC药物治疗改善病程并减少LTX需求，但熊去氧胆酸（ursodeoxycholic acid, UDCA）不直接靶向免疫介导特征。PSC尚无FDA/EMA批准治疗，进展至肝硬化、胆管癌（cholangiocarcinoma, CCA）风险增加，并因复发性胆管炎、疲劳和瘙痒严重影响生活质量。PSC常诊断晚，组织学呈片状，难以时空解析发病机制。NOD.c3c4小鼠自发胆管周围免疫浸润、肝外胆树增大，类似PSC，并有抗AMA M2抗体和免疫浸润类似PBC；其胆管囊肿进行性发展依赖胆管周围免疫浸润，纤维化有限；T细胞重要，T细胞耗竭可挽救表型，自然杀伤T细胞激活；Pkhd1基因特定突变是表型必需。传统免疫组化（immunohistochemistry, IHC）和流式细胞术时空粒度有限且预设标志偏倚。因此研究人员结合空间转录组学和单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq），检查不同年龄小鼠，识别导致和驱动胆管炎症的细胞类型和互作伴侣，并用T细胞-胆管细胞共培养功能测试，在人PSC样本交叉验证。该研究发表于《Journal of Hepatology》。

关键技术方法：研究人员采用NOD.c3c4小鼠，在10、20、40周龄取材，进行空间转录组学（Visium, 10x Genomics）和3’单细胞RNA测序（scRNA-seq, 10x Genomics）。用条件自回归去卷积（conditional autoregressive-based deconvolution, CARD）对空间转录组去卷积，结合Loupe Browser分析差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），并用CellphoneDB筛选T细胞受体-配体相互作用。通过免疫荧光（immunofluorescence, IF）和IHC定位蛋白。功能实验使用小鼠大胆管细胞（murine large cholangiocyte, mLC）与不变自然杀伤T细胞（invariant natural killer T, iNKT）杂交瘤DN32.D3共培养，siRNA敲低Nectin2后检测IL-2。体内用抗CD226抗体阻断NOD.c3c4小鼠。人样本方面，分析已发表PSC/PBC/ALD肝空间转录组数据，并使用NoPSC生物样本库PSC=10、肝硬化对照=4的肝样本进行免疫荧光和邻近分析。

研究结果：
空间转录组学区分炎症与非炎症肝组织。对10、20、40周龄NOD.c3c4小鼠肝脏行空间转录组学，K-means聚类区分炎症和非炎症区域，与组织学一致且随时间稳定。非炎症区高表达肝细胞酶相关转录本，炎症区高表达炎症标志和胆管转录本。10周有限CD45⁺/CD3⁺浸润，20周最大，40周出现胆管囊肿。
scRNA-seq揭示NOD.c3c4小鼠肝脏中11种主要细胞类型，主要定位于炎症胆管。对10和20周小鼠富集活胆管细胞和免疫细胞，分选CD326/EPCAM⁺和CD45⁺，分析8,009个细胞，注释为肝细胞、胆管细胞、胆管细胞祖细胞、内皮细胞、成纤维细胞、粒细胞、单核细胞、浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells, pDCs）、树突状细胞（dendritic cells, DCs）、T/NK和B细胞。CARD去卷积显示免疫细胞几乎仅位于胆管细胞附近；免疫荧光确认CD3⁺T细胞、CD11c⁺经典树突状细胞和F4/80⁺巨噬细胞与KRT19⁺胆管细胞接触。刺激后CD4⁺T细胞强产生TNFα、IFNγ、IL-10，CD8⁺T细胞产生TNFα和IFNγ。
T细胞相互作用促进NOD.c3c4小鼠胆管炎症。选择Krt19高表达捕获点，鉴定10、20、40周炎症与非炎症胆管间DEGs。所有时间点上调DEGs 694个，20和40周仅上调480个。经CellphoneDB和T/NK表达过滤后，发现所有时间点20个、20和40周25个受体-配体对。Cd226-Nectin2细胞类型特异性最清晰：Cd226几乎仅T/NK细胞，Nectin2在胆管细胞、祖细胞和内皮细胞；Cd226为PSC和PBC风险基因。
CD226和NECTIN2定位于胆管周围区域。IHC连续切片显示CD226⁺细胞与CD3⁺T细胞共定位并靠近KRT19⁺胆管；炎症区域胆管结构表达NECTIN2。Cd226⁺T细胞较Ptprc⁺Cd226^-免疫细胞促炎基因上调，基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）显示细胞因子/趋化因子信号、黏着斑和炎症反应。
活化免疫细胞上调胆管细胞NECTIN2，敲低胆管细胞NECTIN2减少T细胞活化。bulk RNA测序显示活化脾细胞与mLC共培养后胆管细胞Nectin2上调，Pvr（Cd155）不上调。NOD.c3c4 scRNA-seq显示胆管细胞Pvr低表达，T细胞Tigit几乎缺失。siRNA敲低mLC的Nectin2后，与CD226⁺ iNKT杂交瘤DN32.D3共培养，IL-2显著减少。
NOD.c3c4小鼠体内CD226阻断使肝脏T细胞转向低活化表型。从断奶起抗CD226抗体或同型对照5周，10周分析。抗CD226未改变肝脏CD3⁺T细胞数量，但减少CD226⁺细胞；总体免疫组成无变化，肝脏na?ve CD4⁺和CD8⁺T细胞增加，效应记忆细胞减少；CD69⁺和IL-13⁺肝脏CD4⁺T细胞减少，IL-17A呈减少趋势。脾中无相应变化，IHC确认靶点结合且无T细胞非特异性耗竭。
CD226-NECTIN2相互作用在人PSC肝脏胆管炎症区域富集。查询PSC、PBC和ALD肝空间转录组，检测到CD226和NECTIN2表达及CD226⁺/NECTIN2⁺区域；PSC中CD226⁺点位于实质与纤维化之间，高于PBC和ALD。10例PSC和4例肝硬化对照免疫荧光及邻近分析显示，NECTIN2⁺KRT19⁺比例或CD3⁺T细胞邻域无差异；但PSC中KRT19⁺周围CD226⁺CD3⁺T细胞有增加趋势，NECTIN2⁺KRT19⁺胆管细胞周围CD226⁺CD3⁺T细胞显著更高。

讨论部分总结：讨论认为，本研究以时空方式剖析NOD.c3c4小鼠胆管周围免疫浸润，定义炎症与非炎症胆管，识别Cd226-Nectin2互作。功能上，活化T细胞上调Nectin2，敲低NECTIN2减少免疫活化。NOD.c3c4是唯一自发人类免疫介导胆管疾病模型，代表PSC和PBC特征。空间转录组可分离炎症和非炎症组织，scRNA-seq参考改善CARD去卷积，细胞类型由整个转录组定义。CellphoneDB分析聚焦T细胞，严格选择可能低估新互作，但优先已知生物学相关性。Cd226在T细胞、Nectin2在胆管细胞表达，功能相关。体内CD226阻断使肝脏CD4⁺和CD8⁺T细胞向na?ve和低活化表型转变。CD226位点是PSC和PBC风险基因，CD226又称TLiSA1或DNAM-1，属免疫球蛋白超家族，参与T/NK活化；CD226-NECTIN2与NK细胞裂解相关，提示胆管损伤机制。人PSC中CD226⁺T细胞围绕NECTIN2⁺胆管细胞增加；CD226变异也与1型糖尿病、类风湿关节炎和多发性硬化相关。除Cd226-Nectin2外，还鉴定44个其他T细胞相关互作，包括Sema4d（Cd100）。未来研究这些附加互作；转录组和CellphoneDB分析可作为资源。

研究结论翻译：总之，研究人员在胆汁淤积性免疫疾病小鼠模型中采用系统的空间和时间方法，鉴定出与人类疾病相关的疾病相关相互作用。该方法代表了一个框架，可用于利用组合测序技术和系统跨物种评估的优势。