化学重编程成人肺泡Ⅱ型细胞获得可扩增肺泡祖细胞样平台并重演肺芽至肺泡发育

《Advanced Science》：Endowing Flexibility of Alveolar Type II Cells to Recapitulate Development From Lung Bud to Alveoli

肺泡Ⅱ型（alveolar type 2，AT2）细胞于肺发育中起源于肺芽尖祖细胞，并通过表面活性物质分泌与再生能力维持肺稳态；然而其可塑性在体外难以建模，限制了疾病建模与再生治疗应用。研究人员开发了一种化学定义重编程策略，可高效将成人人AT2细胞转化为具高扩增性的肺泡祖细胞样状态，在晚代次中接近原始肺芽尖上皮。这些祖细胞可自组织为三维肺泡祖细胞样类器官（alveolar progenitor-like organoids，APLOs），并可进一步高效分化为成熟肺泡样类器官（alveolar-like organoids，ALOs）。体外中，ALOs可作为生理相关平台建模流感A病毒（influenza A virus，IAV）感染并启动以干扰素信号为特征的天生免疫应答，从而支持病毒致病机制与宿主防御的机制研究。体内中，向肺损伤小鼠气管移植后，APLO来源细胞稳定植入并分化为肺泡上皮谱系，改善肺功能。该研究的成人来源、可扩增肺泡祖细胞平台通过化学重编程重现肺泡发育、疾病建模与再生潜能的关键环节。

研究背景方面，肺部疾病是全球第三大死因，肺泡上皮损伤见于慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化及严重感染如SARS与COVID-19。AT2细胞是肺泡上皮干细胞，可自我更新并分化为AT1细胞参与修复；原代成人AT2类器官虽有感染建模价值，但增殖慢、起始材料需求大、难以规模化。人多能干细胞（pluripotent stem cells，PSC）衍生成AT2样细胞可扩增且遗传可控，但分化流程长、异质性强、存在发育不成熟与安全顾虑。胎儿肺芽尖细胞能扩张并分化为AT2，但胎儿组织获取受限且涉及伦理。因此，建立成人来源、可长期扩增、能重演发育轨迹的肺泡上皮平台具有重要价值。该研究发表于《Advanced Science》，研究人员建立化学定义重编程体系，将成人AT2细胞去分化为可扩增肺泡祖细胞样细胞（APLCs），晚代次稳定为肺芽尖样细胞（bud tip-like cells，BTLCs），进而生成APLOs、芽尖样类器官（bud tip-like organoids，BTLOs）与ALOs，并在IAV感染与小鼠肺损伤移植中验证其功能与再生潜力。

主要关键技术方法包括：从健康供体肺远端实质经流式分选HTII-280阳性AT2细胞；二维AEGM化学重编程与长期扩增；单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）解析APLCs与类器官组成及轨迹；三维Matrigel悬浮培养建APLOs/BTLOs并以肺泡分化培养基诱导ALOs；转录组、免疫荧光、蛋白印迹与透射电镜评估成熟度和板层小体；以ALOs建立IAV感染模型并做批量RNA测序；在博来霉素诱导的免疫缺陷小鼠中气管移植APLO来源细胞评估植入与肺功能。样本来自健康供体人肺组织及人胎肺参考数据集。

研究结果如下。2.1 建立化学定义条件实现肺泡上皮细胞长期大规模扩增：研究人员以含CHIR99021、Y27632、A83-01、FGF10、EGF的肺泡上皮生长培养基（AEGM）培养原代AT2细胞，可连续传代超30代，多供体可重复，核型稳定；qPCR与批量RNA测序显示早代高表达SFTPB、SFTPC、SFTPD、ABCA3，随传代下降，SOX9、SOX2、ETV5、ID2等祖细胞转录因子上升，基底、分泌、纤毛谱系标记不表达，证实AT2向祖细胞样状态去分化，命名为APLCs。

2.2 单细胞RNA测序进一步定义肺泡上皮来源祖细胞样细胞特征：P5与P15的scRNA-seq显示集群含AT2、AT1、芽尖祖细胞（bud tip progenitor cells，BTPCs）、增殖AT2、增殖BTPCs与瞬态细胞；早代AT2为主，晚代BTPCs占优并被定义为BTLCs；无TP63、FOXJ1、SCGB3A2表达，CytoTRACE干性评分随传代升高，证明单向向祖细胞状态转变。

2.3 生成肺泡祖细胞样类器官、芽尖样类器官与肺泡样类器官：APLCs在Matrigel悬浮中形成APLOs，P15者形成SOX9⁺ BTLOs；肺泡分化后获ALOs，表达SFTPA/B/C/D、LAMP3、NAPSA、HTII-280及AT1标记AGER、AQP5、CAV1，透射电镜见板层小体，磷脂摄取与LysoTracker染色支持表面活性物质相关脂类处理，NKX2-1全程维持，证明APLO/BTLO可成熟为具AT2与部分AT1特征的ALOs。

2.4 单细胞RNA测序揭示肺泡细胞去分化与再分化过程：APLOs、BTLOs、ALOs的scRNA-seq显示BTLOs富BTPCs，ALOs中AT2与AT1增多、增殖BTPCs减少；CytoTRACE示BTLOs干性最高，分化后下降；拟时间与RNA速率支持AT2向BTPC去分化后再向AT2/AT1再分化；与5–22孕周人胎肺图谱整合显示BTLCs/BTLOs近似远端芽尖祖细胞，ALOs与成人AT2参考高度重叠且主要映射AT2区、少数AT1区。

2.5 用肺泡样类器官建立流感A病毒感染模型：ALOs经机械破碎后感染IAV，空斑与qPCR显示ALOs病毒载量与感染力显著高于APLOs/BTLOs；NP免疫荧光与电镜见细胞质及囊泡内病毒颗粒；批量RNA测序示趋化因子、白细胞介素、TNF与干扰素信号激活，ALOs反应更强，24小时富集抗病毒与干扰素过程、48小时转向凋亡调控，且因无免疫细胞而呈细胞自主天生免疫，证明ALOs是IAV致病研究的相关体外模型。

2.6 肺泡祖细胞样类器官体内移植后的植入与分化：博来霉素损伤B-NDG小鼠气管植入APLO来源细胞，3天见HuLamin A+C人细胞少量植入且MKI67、SOX9阳性；7天形成较大簇并出现proSFTPC；21天以立方proSFTPC⁺ AT2样簇为主，少量PDPN⁺ AT1样细胞，增殖/祖标志减少；CD31⁺宿主血管与移植物毗邻；血氧饱和度SO₂在移植组高于PBS组，说明APLOs存活、扩增、向肺泡样表型转变并与宿主血管关联，部分延缓氧合下降。

讨论部分总结：研究人员指出该平台克服原代AT2难扩增、PSC流程复杂与胎儿组织受限等问题，APLCs-BTLOs-ALOs轴重演肺芽尖到肺泡成熟。ALOs具板层小体、表面活性物质合成分泌、磷脂转运及AT1相关特征，但AT1成熟不完全，未来可引入LATS抑制促进iAT1成熟。IAV模型保留极化上皮与肺泡标记，优于转化细胞系。体内移植产生以AT2样为主、AT1样为辅的修复性上皮，并部分保存血氧，但非逆转纤维化；获益可能来自AT2样结构、表面活性物质、对受损区支持和血管旁定位。结论部分译为：研究人员表明，成人AT2细胞可通过化学重编程以祖细胞样状态扩增，并分化为具显著AT2及附加AT1相关特征的肺泡上皮细胞；所得ALO系统保留人肺泡上皮关键特征，可为肺泡上皮发育、呼吸道病毒感染与组织修复研究提供有用模型，其疾病建模相关性与转化研究潜力尚需进一步研究。