大规模多中心血清代谢特征用于肝癌诊断及烟酰胺经NAD+/SIRT1/HIF1α轴促进肝癌进展的机制研究

《Advanced Science》：Metabolic Signatures for Liver Cancer Diagnosis and Mechanistic Insights: A Large-Scale, Multicenter Study

肝癌（LC）的不良预后凸显了对更有效早期检测策略的迫切需求。研究人员开展了一项大型多中心研究，以开发并验证用于LC诊断的血清代谢特征。利用高通量纳米颗粒增强激光解吸/电离质谱（NPELDI-MS），研究人员分析了来自11个临床中心招募的发现队列中1,924名参与者和来自另外两个中心的独立外部验证队列中225名参与者的血清代谢物。由9种代谢物组成的特征联合甲胎蛋白（AFP）取得了优异的区分性能，在发现队列中曲线下面积（AUC）为0.92，在外部验证队列中为0.93。该联合模型对早期LC也显示出良好的敏感性，在两个队列中分别达到0.85和0.78，并且对肝细胞癌（HCC）表现尤其良好，AUC分别为0.94和0.93。探索性分析提示其对肝内胆管癌（ICC）诊断具有潜在效用。孟德尔随机化（MR）分析支持烟酰胺（NAM）水平与LC风险之间存在潜在因果关联。功能研究表明，NAM通过NAD⁺/SIRT1依赖性机制促进LC细胞增殖、迁移和侵袭，该机制增加HIF1α稳定性并激活糖酵解和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号。总体而言，研究人员开发了一种有前景的LC代谢诊断特征，并确定NAM相关代谢信号是LC进展的潜在促进因素。

该研究发表于《Advanced Science》。肝癌（liver cancer, LC）是全球第六常见癌症和第三位癌症死亡原因，五年生存率仅15.1%；其中肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）占75%–85%，肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC）占10%–15%。早期检测是改善预后的关键，但现行甲胎蛋白（alpha-fetoprotein, AFP）联合腹部超声监测中，AFP对HCC敏感性约45.5%，联合超声亦不超过65%，因此亟需新型有效生物标志物。代谢组学可反映病理过程功能终点，但既往研究多聚焦HCC而忽略ICC，样本量小、单中心、地域多样性不足，且常缺乏独立外部验证；液相色谱-质谱（LC-MS）等传统平台在通量和重复性方面受限。为应对这些缺口，研究人员开展大规模多中心研究，纳入中国13个医学中心超过2,000例样本，使用纳米颗粒增强激光解吸/电离质谱（nanoparticle-enhanced laser desorption/ionization mass spectrometry, NPELDI-MS）开发并验证LC早期检测代谢特征，并在机制上揭示烟酰胺（nicotinamide, NAM）通过NAD⁺/SIRT1/HIF1α轴激活糖酵解和MAPK信号促进LC进展。研究结论显示9代谢物联合AFP具有强区分性能，并提示NAM相关代谢信号参与LC进展。

关键技术方法：发现队列为回顾性多中心队列，来自中国北京、内蒙古、河北、河南、广东5省11个临床中心，2017年1月至2023年12月，年龄小于35岁者排除后纳入1,924例（1,013例LC、911例非LC）；外部验证队列来自Shanxi Cancer Hospital和Hohhot Second Hospital，2024年1月至7月，年龄小于35岁者排除后纳入225例（100例LC、125例非LC）。主要方法包括NPELDI-MS血清代谢谱分析、非靶向代谢组学、傅里叶变换离子回旋共振质谱（FT-ICR MS）与标准品鉴定、最小绝对收缩和选择算子（LASSO）特征选择、朴素贝叶斯（Na?ve Bayes）诊断模型、孟德尔随机化、RNA测序、Transwell迁移侵袭实验、NAD⁺/NADH与乳酸检测、免疫共沉淀（co-IP）和免疫印迹。

2.1 研究队列人口学特征
通过多中心病例对照纳入和临床特征比较，研究人员发现发现队列中LC组中位年龄58.00岁、对照组54.00岁，男性分别为79.37%和52.47%，HBsAg阳性分别为75.02%和73.66%，AFP水平LC组显著升高；HCC 833例、ICC 107例。外部验证队列LC组中位年龄62.00岁、对照组60.00岁，男性分别为85.00%和68.00%，HBsAg阳性分别为69.00%和34.40%，AFP亦显著升高；HCC 84例、ICC 15例。该结果说明两队列临床构成可用于后续诊断模型开发与验证。

2.2 基于NPELDI-MS的高通量血清代谢谱分析
通过建立快速NPELDI-MS平台，研究人员可在数秒内分析1 μL 10倍稀释血清，无需富集或分离，总离子计数约2.06×10⁷，低质量范围100–500 Da呈现显著代谢特征，预处理后获得340个可重复代谢特征。质量控制（quality control, QC）中48个QC样本紧密聚类，5种代表性代谢物强度的相对标准偏差（relative standard deviation, RSD）为19.5%–22.6%，低于代谢组学常用30%阈值；t-SNE未显示中心特异性聚类，支持多中心数据整合；PCA和UMAP显示LC与非LC明显重叠，提示无监督降维局限，监督机器学习更适合提取区分特征。

2.3 差异代谢物发现与临床相关性
通过差异筛选，研究人员从340个特征中识别37个FDR<0.05的特征，注释为31种代谢物，其中16种上调、15种下调；31代谢物Na?ve Bayes模型AUC为0.83，准确率73.7%。LASSO回归筛选重要性评分≥0.20的11代谢物模型，校正年龄、性别和中心后AUC为0.85，准确率75.4%。与临床参数相关分析显示，苯丙氨酸和酪氨酸与凝血酶原时间（PT）和天冬氨酸转氨酶（AST）正相关，与凝血酶原活动度（PTA）、胆碱酯酶（CHE）和白蛋白负相关，并与AFP正相关；白蛋白与乙酰乙酸、乙醛酸、NAM和尿苷负相关。该结果表明代谢特征与肝功能受损和肿瘤侵袭相关。

2.4 LC诊断模型构建、优化和验证
通过去除高度相关代谢物对（苯丙氨酸与酪氨酸 r=0.96；2-羟基-3-甲基丁酸与乙酰乙酸 r=0.91），研究人员得到9代谢物（9-M）模型，包括尿苷、NAM、L-丙氨酸、L-酪氨酸、乙醛酸、氨甲酰磷酸、亚油酸、1-甲基尿酸和2-羟基-3-甲基丁酸；其AUC在发现队列为0.85、外部验证为0.84，在AFP阴性人群仍稳健。9-M联合AFP后，发现队列AUC 0.92、准确性83.6%，外部验证AUC 0.93、准确性84.0%；敏感性从AFP单独0.39提高至0.84（发现队列），从0.43提高至0.83（验证队列），并保持较高特异性。该联合模型可区分HBV相关LC与慢性乙型肝炎、LC与肝硬化；早期I&II期LC敏感性分别为0.85和0.78；HCC的AUC为0.94和0.93，ICC的AUC为0.86和0.95，决策曲线分析支持临床净获益。

2.5 NAM促进LC细胞增殖、迁移和侵袭
通过对31种差异代谢物进行通路富集，研究人员发现其富集于芳香族氨基酸生物合成与代谢、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢，以及烟酸和烟酰胺代谢；维生素B3家族代谢物在LC中上调。孟德尔随机化分析支持遗传预测NAM水平与LC风险存在潜在因果关联；血清NAM随肿瘤分期增加，远处转移患者高于无转移患者。体外实验中，NAM浓度依赖促进LC细胞增殖，并增强迁移和侵袭。对NAM处理的LC细胞进行RNA测序，发现1,878个上调、1,020个下调基因，富集于HIF1α、MAPK和糖酵解通路；分子验证显示NAM上调HIF1α蛋白并激活其下游MAPK和糖酵解通路，SLC2A1（编码Glut1）和VEGFA（编码VEGF）表达及乳酸产生增加。

2.6 NAM通过NAD⁺/SIRT1依赖通路上调HIF1α表达
通过聚焦NAM作为NAD⁺合成前体的作用，研究人员发现NAMPT抑制剂Daporinad可完全消除NAM促增殖效应，NAM升高细胞内NAD⁺水平和NAD⁺/NADH比值。Daporinad或SIRT1抑制剂EX527均可抑制HIF1α蛋白及其下游靶基因转录；NAM诱导的HIF1α上调和下游信号激活被二者逆转，NAM驱动的迁移侵袭增强也被阻断。co-IP证实HIF1α与SIRT1相互作用，NAM降低HIF1α乙酰化和泛素化水平；cycloheximide追踪显示EX527缩短HIF1α半衰期，蛋白酶体抑制剂MG132可挽救其降低。该结果表明NAM激活NAD⁺/SIRT1轴，经去乙酰化稳定HIF1α，进而激活MAPK和糖酵解，促进LC进展。

2.7 NAM与HBV相关LC相关
通过比较健康对照（HC）、慢性乙型肝炎（CHB）、非HBV相关LC和HBV相关LC四组血清NAM，研究人员发现NAM在CHB组高于HC，在HBV-LC组高于非HBV-LC组，且HBV-LC组高于CHB组，而非HBV-LC与HC无显著差异，呈HC
讨论部分总结：研究人员指出AFP敏感度不足，AFP-L3和DCP特异性高但敏感性不稳定，GALAD评分仅边际改善。代谢组学位于中心法则末端，可放大上游变化，生物流体中稳定，样本需求低。NPELDI-MS克服LC-MS局限，仅需1 μL血清、每芯片可分析300余样本，并可与干血清斑结合形成标准化流程。多中心设计解决代谢标志物外部泛化难题，9-M+AFP在外部验证中对早期LC的AUC超过0.90。九种代谢物多具肝致癌机制基础，如苯丙氨酸/酪氨酸代谢、亚油酸、氨甲酰磷酸、2-羟基-3-甲基丁酸、1-甲基尿酸。NAM虽为皮肤癌预防剂，但在LC血清中升高并显示促进展作用；研究提出与既往NAM抑制SIRT1观点不矛盾，即细胞内NAM主要作为NAD⁺前体持续激活SIRT1；在HBV相关LC中，HBV感染升高NAM，NAM激活SIRT1并可能增强HBV复制，形成正反馈。研究提示过量NAM补充在HBV相关LC中的风险，以及NAMPT抑制剂治疗潜力；相较Luo et al.，本模型对ICC显示探索性价值。局限包括医院人群谱偏倚、QC为5标准混合物而非混合QC、部分代谢物倍数变化小于1.5但FDR显著、ICC例数少且缺乏ICC机制实验。

研究结论翻译：总之，研究人员开发了一种由9种代谢物组成的特征联合AFP，在基于医院的多中心队列和独立外部验证队列中，对LC（包括早期疾病）显示出强区分性能。该模型对HCC表现尤其良好，而由于ICC病例数有限，其对ICC的性能仍属探索性。NAM与HBV相关LC相关，并在体外通过潜在的NAD⁺/SIRT1依赖性HIF1α通路促进LC细胞增殖、迁移和侵袭。这些发现支持进一步前瞻性验证和机制研究，特别是在基于人群的监测队列和ICC模型中。