乙二醇和PEG400存在条件下pH对α-乳白蛋白构象的双重介导效应：一种生物物理与计算方法研究

《Journal of Molecular Structure》：pH-mediated dual effect on α-Lactalbumin conformation in presence of ethylene glycol and PEG400: A biophysical and computational approach

　　• 在不同 pH 条件下，研究了 EG 和 PEG400 存在下 α-LA 的聚集。• 两种拥挤剂均表现出强烈的、不均匀的、pH 依赖性的双重调控作用。• 分析显示，在碱性 pH 下促进聚集，而在酸性 pH 下抑制聚集。• 总体而言，PEG400 对 α-LA 聚集的调控作用强于 EG。**引言**蛋白质折叠与聚集是细胞生物学中的基本现象，决定了细胞的功能与活力。蛋白质结构具有多个组织层次，如一级、二级、三级和四级结构，其内在复杂性使其对不同的理化环境变化极为敏感。这些变化通常与结构失稳过程相关，包括部分去折叠、错误折叠或最终导致蛋白质聚集。蛋白质聚集通常与多种神经退行性疾病病理以及体外观察到的不同蛋白质的细胞毒性行为有关。小分子（包括表面活性剂、金属，以及脂质、肽聚糖和姜黄素等天然化合物）已被证明可诱发蛋白质聚集。这些分子与不同蛋白质建立不同的相互作用，并形成不同程度的结构构象。蛋白质聚集的分子基础反映了环境因素与分子相互作用之间的复杂交互作用，这取决于细胞密集的胞内环境、离子强度、蛋白质组成与浓度、温度和 pH 值。在引发构象不稳定和错误折叠的这些理化参数中，pH 和共同溶剂组成尤为关键。周围的 pH 直接影响氨基酸残基的电离状态、电荷分布和结构动力学，从而调节蛋白质的溶解度、折叠能量景观、表面疏水性和聚集特征。极端酸性和碱性条件可使蛋白质去折叠，但当 pH 变为中性时，这些去折叠蛋白质会重新折叠为更紧密的熔球状态。研究还表明，这种 pH 变化及熔球状态的形成也可通过细胞稳态和应激反应受拥挤的细胞环境影响。标准缓冲液实验通常无法复制细胞密集环境，因此为了模拟体外分子拥挤，聚乙烯醇（PEG）及其单体乙二醇（EG）被广泛用作拥挤剂。这些拥挤剂可表现出聚集促进或抑制的双重作用，具体取决于其与蛋白质水合壳的相互作用。EG 和 PEG 均可通过选择性排斥增加构象刚性或阻止蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs），具体取决于其浓度。此外，这些拥挤剂会改变溶剂极性或介电常数，从而调节蛋白质溶剂化层，影响蛋白质折叠路径和聚集倾向。尽管已有若干研究分别探讨了两种拥挤剂及 pH 各自对蛋白质聚集的影响，但尚无研究考察拥挤剂与 pH 变化组合对蛋白质聚集行为的影响，本研究旨在填补这一空白。本文使用了 α-乳白蛋白（α-LA），它是研究起泡性、乳化性、构象变化和聚集性质最广泛的蛋白质之一。它是一种小的酸性球状蛋白，是牛奶中的第二大主要成分，其结构稳定性对其营养和功能特性至关重要。α-LA 是一种分子量为 14.2 KDa、等电点在 4 至 5 之间的 Ca2? 结合蛋白，在乳糖合成中具有生理作用。α-LA 在结构上由主要 α 亚结构域和次要 β 亚结构域组成，二者由一条深裂缝分隔，并由 4 个二硫键（S-S 键）支撑。α-LA 的稳定性高度依赖于其 Ca2? 结合特性，因为 Ca2? 的去除会导致蛋白质聚集。溶剂条件，如拥挤剂的存在、pH 和温度，也可改变 α-LA 的构象。随着 pH 降低至酸性范围，α-LA 带更多正电荷，并达到具有改变的结构特征的熔球状态。在酸性条件下，α-LA 还可形成淀粉样纤维，后者具有包括对肿瘤细胞杀菌和细胞毒性在内的生物活性。α-LA 提供必需氨基酸，因此对于支持新生儿最佳生长的营养至关重要。若干研究表明，α-LA 具有免疫活性、抗病毒活性，并对肠道微生物组有影响，在工业应用中发挥关键作用。本文将展示小分子拥挤剂如何在宽广的 pH 范围（2.0、4.5、7.0、9.0 和 12.0）内调节 α-LA 的聚集行为。由于拥挤剂与 α-LA 之间的相互作用主要取决于蛋白质的电子状态，因此提供了关于拥挤环境如何影响聚集路径的机制性洞见。通过生物物理和计算技术考察了 pH 依赖性的结构稳定性与聚集特征。采用淀粉样敏感染料结合测定法监测纤维形成和表面疏水性的调节情况。利用光散射测量评估粒径，并通过显微方法确认结构形态。这些分析提供的洞见非常有用，因为 pH 变化与拥挤环境是食品工业中必须考虑的重要因素，它们可显著影响结构-功能关系。**各章节片段****材料与方法**牛 α-LA 冻干粉（纯度 ≥ 85%）、乙二醇（纯度 ≥ 99.8%）、PEG400 Da（纯度 ≥ 99%）购自 Sigma-Aldrich，未经进一步纯化直接使用。甘氨酸、三水合乙酸钠晶体、磷酸氢二钠（无水）、Tris（羟甲基）氨基甲烷、二水合磷酸氢二钠（无水）、HCl 和 NaOH 购自 Hi-media。所有使用的化学试剂和溶剂均为分析纯，并使用去离子水配制。**ThT 荧光测定**采用 ThT 荧光测定法评估在不同 pH 条件（2.0、4.5、7.0 和 9.0）下 PEG400 和乙二醇对 α-LA 聚集行为的影响。ThT 荧光的差异反映了构象变化，表明两种拥挤剂对 α-LA 聚集的调控作用。ThT 荧光可根据溶剂极性和 ThT 掺入淀粉样纤维的情况从较短波长偏移至较长波长。溶液……**讨论**蛋白质错误折叠与聚集已成为现代生物化学和生物物理研究的重点，因为正确折叠的结构对其生物功能和活性至关重要。理解蛋白质如何错误折叠至关重要，因为此类事件与多种人类疾病密切相关。处于部分折叠或中间构象的蛋白质通常比完全折叠状态更容易聚集。这些……**结论**本研究在不同 pH 值下研究了 EG 和 PEG400 对 α-LA 的影响，以探究聚集调控机制。光谱技术共同显示了与 α-LA 蛋白在宽广 pH 范围内结构转变相关的一致数据。显微和分子动力学模拟研究进一步考察了由 pH 变化引起的微观结构改变。结果清楚地显示了 pH 敏感性，其二级结构发生改变并出现部分去折叠……**作者贡献声明****Priyanka Mudad**：构思、形式化分析、项目管理、初稿撰写、审阅与编辑；**Bhanu Pratap Gurjar**：分子动力学模拟、撰写、形式化分析、数据验证与编辑；**Danish Alam**：形式化分析、审阅与编辑；**Arun S. Kharat**：形式化分析、项目管理、撰写与编辑、数据分析、数据验证；**Asimul Islam**：形式化分析、项目管理、撰写与编辑、数据分析、数据验证。全体……**机构审查委员会声明**不适用。**知情同意声明**不适用。**CRediT 作者贡献声明****Priyanka Mudad**：撰写——审阅与编辑、可视化、验证、方法论、调查、形式化分析、数据整理、构思。**Bhanu Pratap Gurjar**：撰写——审阅与编辑、可视化、方法论、构思。**Danish Alam**：撰写——审阅与编辑、可视化、方法论、数据整理。**Arun S. Kharat**：撰写——审阅与编辑、可视化、验证、项目管理、形式化分析。**Asimul Islam**：撰写——审阅与编辑、可视化……**利益冲突声明**作者声明，他们不存在已知的可能影响本文所报告工作的竞争财务利益或个人关系。**致谢**P.M. 感谢印度科学与工业研究委员会（CSIR）人力资源开发小组的高级研究奖学金（09/0263(11426)/2021-EMR-I）。D.A. 感谢印度生物技术部（DBT）提供的初级研究奖学金（DBT/2023-24/JMI/2170）。