外源性丙酮酸通过减轻氧化应激保护IMS32 Schwann细胞免受高血糖诱导的成熟过程损害

《The Journal of Physiological Sciences》：Exogenous pyruvate protects IMS32 Schwann cells from impairing the maturation process under hyperglycemia

　　

外源性丙酮酸保护IMS32 Schwann细胞免受高血糖（hyperglycemia）下成熟过程受损。高血糖损害IMS32 Schwann细胞的成熟。高血糖增强Schwann细胞成熟过程中的氧化应激（oxidative stress）。外源性丙酮酸通过减轻氧化应激恢复受损的成熟。Schwann细胞成熟受损是糖尿病感觉运动多发性神经病（diabetic sensorimotor polyneuropathy, DSPN）的致病机制之一。

糖尿病感觉运动多发性神经病（diabetic sensorimotor polyneuropathy, DSPN）是糖尿病主要慢性并发症之一。持续高血糖可损害周围神经系统（peripheral nervous system, PNS）微血管供应和代谢，导致线粒体功能障碍和氧化应激，包括神经元和Schwann细胞中活性氧（reactive oxygen species, ROS）过量产生。目前除控制血糖外，尚无有效的基于发病机制的治疗。Schwann细胞是PNS胶质细胞，通过代谢和神经营养支持维持神经元存活和功能，其成熟受严格调控。高血糖可增强坐骨神经、原代培养Schwann细胞和IMS32 Schwann细胞系去分化或异常髓鞘化，但分子机制不清。IMS32细胞表达并上调醛糖还原酶，即多元醇途径限速酶，在高血糖下增强葡萄糖通量和氧化应激。forskolin（福司柯林）作为Schwann细胞成熟激活剂，可使IMS32上调2',3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶（2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase, CNPase）和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）等标志物，提示IMS32保留未成熟Schwann细胞特征。既往研究显示高血糖诱导IMS32氧化应激和细胞死亡，但高血糖对Schwann细胞成熟的影响及机制不清。因此，研究人员研究高血糖对forskolin处理的IMS32 Schwann细胞成熟的影响。既往发现外源性丙酮酸减轻高糖下IMS32氧化应激并恢复细胞活力，且改善ND7/23细胞（背根神经节神经元细胞系，dorsal root ganglion neuron cell line）高血糖诱导病变和链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）诱导糖尿病小鼠感觉功能障碍，但是否保护Schwann细胞成熟未知。因此，研究人员评估外源性丙酮酸是否改善高血糖下成熟受损。研究得出，高血糖损害IMS32 Schwann细胞成熟并升高氧化应激，外源性丙酮酸通过减轻氧化应激恢复受损成熟；这提示Schwann细胞成熟受损是DSPN致病机制之一，并可能为基于发病机制的治疗提供思路。

关键技术方法方面，研究人员使用自发永生化成年小鼠Schwann细胞系IMS32（Cosmo Bio, Tokyo, Japan），以5 μM forskolin诱导成熟，并设置正常葡萄糖、高葡萄糖及高甘露醇渗透对照。通过形态学测量细胞过程长度并定义过程长度>30 μm为成熟细胞；采用MBP、CNPase、GFAP及ARE驱动的EGFP启动子报告质粒评估成熟标志物和Nrf2转录活性；采用免疫印迹检测MBP、CNPase、GFAP和Actin；采用荧光探针检测ROS和线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, MMP），采用Aqueous One检测细胞活力；统计采用t检验、方差分析及Tukey或Dunnett检验。研究无人类样本队列。

研究结果：
（1）Hyperglycemia impaired the maturation process in forskolin-treated IMS32 Schwann cells（高血糖损害经forskolin处理的IMS32 Schwann细胞成熟过程）。通过形态学分析发现，无forskolin时IMS32呈纺锤形，forskolin处理后细胞过程时间依赖性伸长；成熟细胞比例从约30%升至80%，5 h达峰。高糖减少成熟IMS32细胞数量并缩短过程长度。通过髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein, MBP）、CNPase和GFAP启动子报告实验发现，高糖下各启动子驱动EGFP阳性细胞由正常约10%显著降至约3%；25 mM葡萄糖已出现下降，50和100 mM更明显，而细胞活力不受影响。免疫印迹显示高糖下MBP、CNPase和GFAP蛋白表达显著降低。高甘露醇条件下无显著差异，表明高血糖而非渗透应激损害成熟。

（2）Oxidative stress was elevated under hyperglycemia during maturation（成熟过程中高血糖升高氧化应激）。通过ROS检测和MMP检测发现，高糖增加forskolin处理IMS32细胞的ROS产生，并伴随MMP下降。通过抗氧化反应元件（antioxidant response elements, AREs）驱动启动子实验发现，高糖下ARE驱动EGFP阳性细胞显著增加，提示ARE启动子反映ROS产生和抗氧化反应；核因子E2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2–related factor 2, Nrf2）活性相关抗氧化反应增强，氧化应激可能抑制高糖下IMS32 Schwann细胞成熟。

（3）Pyruvate supplementation restored the impairment of IMS32 maturation under high-glucose conditions（丙酮酸补充恢复高糖条件下IMS32成熟受损）。通过形态学分析发现，外源性丙酮酸补充恢复高糖下IMS32细胞过程长度和成熟。通过MBP、CNPase、GFAP启动子报告实验和免疫印迹发现，丙酮酸处理恢复各启动子驱动EGFP阳性细胞，并防止高糖下MBP、CNPase和GFAP蛋白下降。结果提示外源性丙酮酸可逆转高血糖诱导的IMS32成熟缺陷。

（4）Pyruvate supplementation protected IMS32 cells against oxidative stress under hyperglycemic conditions（丙酮酸补充保护IMS32细胞免受高糖下氧化应激）。通过ROS、MMP和ARE启动子实验发现，丙酮酸处理恢复ROS水平和MMP，并逆转ARE驱动EGFP阳性细胞增加。N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl L-cysteine, NAC）补充也恢复高糖下GFAP、CNPase和MBP启动子驱动的EGFP阳性细胞。结果支持氧化应激参与高血糖损害的Schwann细胞成熟，外源性丙酮酸通过减轻氧化应激恢复IMS32成熟。

讨论部分中，研究人员将“Schwann细胞成熟”定义为包括形态分化、成熟相关基因激活和相应蛋白表达的连续过程，而非单一终点。过程伸长是早期形态指标，早于GFAP、CNPase和MBP表达，因此约80%细胞出现过程伸长，但仅一部分进展至表达成熟标志物；启动子实验与免疫印迹一致性支持互补方法。IMS32经forskolin处理可上调Schwann细胞标志物并发生类似原代培养Schwann细胞的形态变化；高血糖减少过程长度，说明IMS32保留未成熟表型，高糖损害其成熟。过量ROS是DSPN主要致病机制并促进PNS脱髓鞘；ARE启动子反映Nrf2活性，显示成熟过程中ROS产生与抗氧化反应相关，提示氧化应激可能损害多种细胞成熟。内源性丙酮酸是糖酵解终产物，可转化为乳酸或乙酰辅酶A进入三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle, TCA）；高血糖通过抑制GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）活性损害糖酵解通量，限制丙酮酸产生。外源性丙酮酸经单羧酸转运体（monocarboxylate transporters, MCTs）进入细胞，直接供应胞内丙酮酸，并通过直接和间接途径保护细胞抗氧化应激：作为H₂O₂清除剂，上调抗氧化或厌氧糖酵解相关基因，维持糖酵解、糖酵解侧支和TCA通量。丙酮酸在成纤维细胞和胚胎干细胞中调节抗氧化应激反应可伴或不伴核因子κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-κB）易位；乙基丙酮酸增强Nrf2从细胞质到细胞核易位及与AREs结合，诱导血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）和谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase, GST）等抗氧化基因。本研究中丙酮酸减少ARE驱动EGFP阳性，提示在IMS32中丙酮酸可能作为ROS清除剂或葡萄糖代谢调节剂，而非诱导ARE介导抗氧化基因表达。结合既往研究，外源性丙酮酸可能通过减少氧化应激和维持高血糖下葡萄糖代谢调节Schwann细胞ROS产生。Schwann细胞通过提供代谢物、促进轴突生长和减少氧化应激支持神经元存活和功能，正常成熟对提供这些支持功能必要。高血糖损害成熟并增强去分化和异常髓鞘化，研究人员认为这些功能障碍是DSPN重要贡献者，保护Schwann细胞免受高血糖诱导应激可能是基于发病机制的治疗靶点。局限包括：forskolin增强的IMS32成熟损害在25 mM或更高葡萄糖观察到；丙酮酸终浓度5和10 mM恢复成熟，至少部分通过抗氧化活性；尽管丙酮酸给予STZ糖尿病小鼠改善神经突退化和感觉，但丙酮酸对Schwann细胞的益处不清；研究葡萄糖和丙酮酸浓度超生理；需体内模型确定机制是否反映糖尿病条件下Schwann成熟。DCFH-DA虽广泛用于胞内氧化应激，但为非特异探针且易受伪影影响；NAC实验支持氧化应激参与高血糖损害Schwann成熟，但仍需进一步研究机制。ARE启动子驱动EGFP阳性分布似乎分为低或高比例组，原因不清，可能forskolin处理IMS32成熟状态差异导致。

研究结论翻译：总之，高血糖损害IMS32 Schwann细胞的成熟并升高氧化应激。外源性丙酮酸在高糖条件下改善这些异常。这些发现提示氧化应激可能促进Schwann细胞成熟受损及DSPN的发病机制。