《British Journal of Pharmacology》：Targeted delivery of the CB2 receptor agonist JWH-133 via VCAM-1-functionalised nanoparticles attenuates atherosclerosis and reveals sex-specific therapeutic outcomes
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摘要
背景与目的： 动脉粥样硬化（atherosclerosis）是一种以脂质积聚和内皮功能障碍为特征的慢性炎症性疾病，仍是心血管疾病发病率和死亡率的主要原因。虽然大麻素2型（CB2）受体激动剂在临床前研究中显示出治疗前景，但其全身应用受到生物利用度差和脱靶效
摘要
背景与目的： 动脉粥样硬化（atherosclerosis）是一种以脂质积聚和内皮功能障碍为特征的慢性炎症性疾病，仍是心血管疾病发病率和死亡率的主要原因。虽然大麻素2型（CB2）受体激动剂在临床前研究中显示出治疗前景，但其全身应用受到生物利用度差和脱靶效应的阻碍。因此，靶向递送系统对于增强治疗效果和减轻不良反应至关重要。
实验方法： 本研究提出了一种靶向纳米治疗策略，将CB2受体激动剂直接定位于动脉粥样硬化病变部位。研究人员开发了封装选择性激动剂JWH-133并用VCAM-1结合肽（VBP）功能化的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米颗粒（NPs），以实现对血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）的选择性结合（VBP-JWH-133-NPs）。在雄性和雌性载脂蛋白E缺陷（ApoE?/?）小鼠中进行了体内实验，以评估该纳米疗法的抗炎和调脂作用。分析了血清脂质谱、主动脉斑块负荷和关键炎症标志物。
主要结果： VBP-JWH-133-NPs在两种性别中均显著减少了富含泡沫细胞的沉积并调节了全身炎症标志物，显示出优于游离JWH-133的抗动脉粥样硬化疗效。治疗获益在雄性小鼠中尤为显著，其初始斑块面积和脂质沉积更大。
结论与意义： 这些发现强调了VBP-JWH-133-NPs作为动脉粥样硬化中大麻素治疗的高效且优越递送系统的潜力。通过将性别作为生物学变量加以考虑，该方法为开发更有效和精准的心血管干预措施提供了精细化的策略。
靶向CB2受体激动剂递送：VCAM-1功能化纳米平台在动脉粥样硬化治疗中的性别依赖性疗效解读
一、研究背景与意义
动脉粥样硬化是一种以脂质积聚、内皮功能障碍和持续性炎症反应为特征的进行性慢性疾病，导致动脉内膜内纤维脂肪斑块的形成，是心肌梗死和脑卒中等心血管疾病（CVDs）的首要病因。尽管他汀类和PCSK9抑制剂等降脂治疗取得了显著进展，但残余心血管风险依然突出，亟需新的治疗策略。
动脉粥样硬化的发展涉及免疫应答、代谢失调和慢性血管炎症之间的复杂相互作用。低密度脂蛋白（LDL）升高并被氧化为氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）后，触发巨噬细胞分化为富含脂质的泡沫细胞——这是早期脂质条纹的标志性特征，也是内皮损伤的驱动因素。促炎刺激诱导血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和E-选择素等细胞黏附分子的表达，促进循环白细胞募集和黏附至动脉内皮，从而传播炎症级联反应。
内源性大麻素系统（ECS）因其在调节炎症信号中的基本作用而成为动脉粥样硬化的有前景的治疗靶点。选择性激活主要表达于巨噬细胞等免疫细胞上的大麻素2型（CB2）受体，可调节细胞因子释放、影响巨噬细胞极化并抑制泡沫细胞形成，在疾病各阶段发挥动脉保护作用。JWH-133是一种高选择性CB2受体激动剂（Ki = 3.4 nM），具有抗氧化、心脏保护、抗炎和保肝等广泛的药理特性。然而，其高亲脂性导致生物利用度差和全身清除快，严重阻碍了临床转化。
为克服这些挑战，基于纳米技术的递送平台被设计用于提高药物稳定性并实现位点特异性递送。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米颗粒（NPs）是可生物降解的FDA批准载体，可实现持续药物释放，减少脱靶效应。表面PEG化可减少非特异性蛋白吸附并减缓单核吞噬细胞系统（MPS）的清除。在此基础上，VCAM-1因其对炎症内皮的高度特异性表达而成为优于ICAM-1的分子靶点，为位点特异性递送提供了更选择性的大门。研究人员前期已优化了将VCAM-1结合肽（VBP）偶联到PEG-PLGA NPs上的方法，证实VBP功能化可将NPs优先导向主动脉弓和腹主动脉，局部浓度较非靶向系统提高7.7倍。然而，前期工作仅限于描述载体的归巢能力和组织特异性积聚，未评估其治疗潜力。
因此，本研究旨在评估负载JWH-133的靶向纳米系统对动脉粥样硬化进展的治疗效果，涵盖能量平衡、体重、血清脂质和全身细胞因子的影响，并对斑块组成和形态进行精细分析。同时，为将性别作为关键生物学变量加以考量，研究采用了雄性和雌性ApoE?/?小鼠，探索CB2受体激动剂治疗中潜在的性别依赖性差异。
二、主要技术方法
研究人员采用纳米沉淀技术合成了PEG化的PLGA NPs，通过马来酰亚胺点击化学将VBP偶联至NPs表面，构建了靶向纳米平台VBP-JWH-133-NPs。利用动态光散射（DLS）、激光多普勒、扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）对NPs进行了理化表征；采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）测定包封效率（EE）和载药量（DL）；通过Micro BCA蛋白检测试剂盒量化偶联效率（CE）；使用KinetDS 3.0软件对体外药物释放数据进行动力学模型拟合。体内研究采用6周龄雄性（n=24）和雌性（n=24）ApoE?/?小鼠（Charles River Laboratories，法国），高脂饮食（HFD）喂养22周诱导动脉粥样硬化后，随机分为三组（每组每性别8只），分别腹腔注射生理盐水、游离JWH-133或VBP-JWH-133-NPs（50 mg·kg?1，相当于7.5 mg·kg?1 JWH-133），每周两次，持续8周。通过酶促比色试剂盒测定血清脂质，ELISA定量IL-6和IL-10，Griess反应测定一氧化氮代谢物（NO(x)），Western blotting分析主动脉蛋白表达，油红O（ORO）染色和Mac-3免疫组化评估斑块脂质沉积和巨噬细胞浸润。
三、研究结果
3.1 VBP功能化PEG化PLGA NPs的工程化与表征
通过纳米沉淀法和马来酰亚胺点击化学成功构建了VBP-JWH-133-NPs。该纳米系统平均粒径约170 nm，多分散指数（PDI）低于0.2，Zeta电位（ZP）为?26至?31 mV，较非功能化NPs（约?21 mV）明显负移，证实了VBP肽层的存在。SEM和TEM确认了均匀、非聚集的球形形态。该平台实现了98.9%（w/w）的高包封效率和约14.9%（w/w）的载药量，马来酰亚胺介导的偶联效率达85.9%，相当于每个NPs表面约6810个肽单元。体外释放研究显示14天内呈延长双相释放曲线，Korsmeyer–Peppas模型拟合最佳（R2=0.979），释放指数A=3.056表明非Fickian的Super Case II转运机制，即由聚合物基质松弛和水解降解控制的溶胀过程。稳定性评估确认了NPs在生理条件、4°C短期储存和?20°C冷冻保存下的胶体稳定性。
3.2 VBP-JWH-133-NPs对动脉粥样硬化小鼠体重和饮食摄入的影响
在8周治疗期间，VBP-JWH-133-NPs组小鼠体重增长显著减缓，达到平台期并在治疗末期出现轻微但显著的下降。游离JWH-133未显著改变最终体重（FBW）、体重增长（BWG）或相对体重增长（RBWG）。VBP-JWH-133-NPs显著降低了两种性别的FBW和BWG，且与未处理ApoE?/? HFD组和游离激动剂组均有显著差异。该靶向纳米疗法还显著降低了每日食物摄入量（DFI），并显著降低了两种性别的食物效率比（FER），表明每单位能量摄入的体重增长减少。此外，VBP-JWH-133-NPs组相对肝脏重量显著降低，其他主要器官相对重量无显著变化，未观察到治疗相关毒性迹象。
3.3 靶向纳米疗法改善全身脂质谱和炎症谱
VBP-JWH-133-NPs使两种性别的总胆固醇（TC）水平显著降低约53%，效果明显优于游离JWH-133。该纳米平台还使甘油三酯（TG）水平显著降低（雄性50.5%，雌性46.9%），同时使高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）水平大幅升高（雄性增加100.8%，雌性增加83.4%）。靶向纳米疗法显著改善了多项动脉粥样硬化风险预测指标：Castelli风险指数I（CRI I）在雄性和雌性中分别降低81.5%和74.4%；血浆致动脉粥样硬化指数（AIP）分别降低93.8%和88.4%；动脉粥样硬化系数（AC）也呈相同改善模式。
在炎症标志物方面，VBP-JWH-133-NPs使雄性IL-6水平较未处理组显著降低35%，优于游离JWH-133的20.1%降幅；雌性中IL-6降低30.8%，而游离激动剂未达统计学显著。该纳米平台还显著上调了抗炎细胞因子IL-10（雄性增加55.4%，雌性增加66.7%）。IL-6/IL-10比值在雄性中显著降低68.3%，在雌性中两种治疗均有效降低该比值。血清亚硝酸盐（NO(x)）水平在两种治疗后均升高，但靶向纳米系统效果更显著（雄性增加3.4倍，雌性增加34.3%）。
3.4 VBP-JWH-133-NPs减少斑块面积、脂质沉积和巨噬细胞浸润
与基线观察一致，未处理的ApoE?/? HFD雌性小鼠的斑块面积显著小于雄性。VBP-JWH-133-NPs治疗使雄性斑块面积显著减少46.9%，雌性减少13.9%；在雄性中，该靶向纳米药物的抗动脉粥样硬化效果显著优于游离JWH-133，额外减少了31.9%的病变面积。血管狭窄分析显示，未处理雄性狭窄程度（60.7%）高于雌性（51.1%），VBP-JWH-133-NPs在两种性别中均显著缓解狭窄（雄性降低69.6%，雌性降低60.7%），且显著优于游离JWH-133。
脂质沉积方面，VBP-JWH-133-NPs使ORO阳性面积在雄性中减少78.9%，雌性中减少58.1%，显著优于游离激动剂。值得注意的是，未处理组和游离JWH-133组中雌性较小的脂质丰富斑块面积差异在VBP-JWH-133-NPs治疗组中被有效消除。巨噬细胞浸润方面，游离JWH-133仅在雄性中显著减少Mac-3阳性面积（34.1%），对雌性无显著效果；而VBP-JWH-133-NPs在两种性别中均实现了显著减少（雄性86.2%，雌性65.8%），且显著优于游离JWH-133。
3.5 VBP-JWH-133-NPs调节主动脉促动脉粥样硬化蛋白标志物
Western blotting分析显示（n≥3，结果作为观察性趋势呈现），VBP-JWH-133-NPs与主动脉VCAM-1和ICAM-1蛋白水平降低相关：雄性分别降低77.7%和31.1%，雌性分别降低46.6%和43.1%。该纳米平台在降低VCAM-1方面似乎优于游离JWH-133。动脉保护酶eNOS水平呈上升趋势：雄性升高252.7%（3.5倍），雌性升高164.1%（2.6倍）。CB2受体表达呈现性别依赖性调节模式：雄性中两种治疗均降低CB2受体水平（游离激动剂降低22.3%，纳米系统降低39.5%）；雌性中VBP-JWH-133-NPs使CB2受体水平维持在接近未处理组水平，而游离JWH-133治疗与29.5%的下降相关。
四、讨论与结论总结
讨论部分指出，VBP-JWH-133-NPs在缓解代谢紊乱和动脉粥样硬化进展方面显著优于游离大麻素，其优越性体现在抗动脉粥样硬化效应和全身代谢参数的多方面增强。靶向纳米平台减轻体重增长和最终体重的效应可能通过调节ECS对能量稳态的影响来实现，伴随的DFI和FER降低指向更高效的代谢平衡。脂质谱的显著改善——TC和TG降低、HDL-c升高——可能归因于CB2受体刺激上调ABCA1和ABCG1等ATP结合盒转运蛋白，促进胆固醇外流并扩大循环HDL池；同时，靶向递送JWH-133抑制全身和血管细胞因子级联反应，可能恢复内皮稳态并保持功能性HDL颗粒的结构稳定性。全身炎症状态的有利转变（IL-6降低、IL-10升高）和血清亚硝酸盐水平的增加支持内皮功能的恢复。组织学证据证实了靶向策略的优越疗效，显著减少斑块面积、血管狭窄、斑块内脂质含量和巨噬细胞浸润。分子分析揭示了VBP介导的递送增强了药物的局部药理学作用，表现为VCAM-1的显著下调、eNOS水平的恢复性升高以及CB2受体表达的性别依赖性调节。雄性中更显著的治疗反应可能与其更高的基线炎症水平和更严重的动脉粥样硬化进展相关，提供了更宽的外源性CB2激动治疗窗口；而雌性中雌激素性动脉保护机制可能部分掩盖了外源性CB2激活的相对影响。
结论部分指出，用VCAM-1靶向肽功能化负载大麻素的NPs显著放大了其抗动脉粥样硬化潜力。VBP-JWH-133-NPs在改善全身代谢谱、减少血管狭窄和调节局部炎症标志物方面明显优于游离药物。通过在病变血管壁最大化治疗浓度同时最小化潜在脱靶效应，该靶向策略代表了动脉粥样硬化及其相关代谢合并症治疗的一个有前景的前沿方向。
