水稻PSY1启动子顺式作用元件恢复联合CrtI表达促进成熟种子类胡萝卜素积累并揭示工程化启动子甲基化状态差异

《Journal of Plant Physiology》：Restoration of cis-acting elements in the rice PSY1 promoter combined with CrtI expression enables carotenoid accumulation in seeds and reveals distinct promoter methylation states

水稻胚乳通常不积累维生素A原类胡萝卜素（provitamin A carotenoids），如β-胡萝卜素（β-carotene）。研究人员的先前工作表明，当与植物八氢番茄红素脱饱和酶（phytoene desaturase, PDS）联合时，水稻PSY1启动子中六个近错配顺式作用元件（near-miss cis-acting elements）的恢复能够支持愈伤组织中类胡萝卜素积累，但该策略未导致成熟种子中类胡萝卜素积累。在此，研究人员测试了将校正后的6M-OsPSY1盒（cassette）与细菌胡萝卜素脱饱和酶CrtI联合，是否能够克服这一限制；CrtI绕过多个内源脱饱和和异构化步骤。共转化愈伤组织系积累了高水平类胡萝卜素，再生植株产生含β-胡萝卜素的成熟种子，达到3.57 μg g^-1 DW。在独立愈伤组织系中，类胡萝卜素积累并未与PSY1或CrtI转录本丰度成比例增加；PSY1转录本丰度与类胡萝卜素积累呈正相关，而CrtI未观察到正相关。在种子中，颜色和类胡萝卜素含量不同的表型类别与工程化6M-OsPSY1启动子的不同甲基化状态相关。这些发现表明，CrtI能够克服先前6M-OsPSY1/PDS系统中仍存在的途径限制，使成熟水稻种子中类胡萝卜素积累成为可能。研究还揭示了启动子甲基化与表型变异之间的关联，尽管当前数据未建立甲基化与类胡萝卜素积累之间的因果关系。

研究背景与问题：维生素A缺乏在依赖水稻（Oryza sativa）为主粮的人群中仍是重要公共卫生挑战，因可食胚乳不积累维生素A原类胡萝卜素（provitamin A carotenoids）。传统补充和强化效果有限，提高胚乳类胡萝卜素含量是营养生物强化目标。水稻胚乳天然不积累类胡萝卜素，但含直接前体牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate, GGPP）；限制主要在于八氢番茄红素合成酶1（phytoene synthase 1, PSY1）量极低，其催化两个GGPP缩合形成八氢番茄红素（phytoene）。常规工程以强启动子或胚乳特异启动子表达PSY1，并加植物或细菌脱饱和酶促进β-胡萝卜素形成，已获Golden Rice 1和Golden Rice 2等。另一策略为沉默潜在胚乳启用启动子（silent latent endosperm-enabled promoters, SLEEPER），即恢复近错配顺式作用元件。Sobrino-Mengual等先前工作显示，校正四个近错配元件（4M-OsPSY1）足以激活GFP报告基因在胚性愈伤和发育种子中表达；将PSY1编码序列置于校正启动子下时，需恢复全部六个基序（6M-OsPSY1）方能在转基因检测系统中生产性激活。6M-OsPSY1与OsPDS共表达增加愈伤组织类胡萝卜素积累，但成熟种子中未检测到β-胡萝卜素，说明PSY1激活加OsPDS不足以克服水稻胚乳下游途径限制。因此，研究人员假设将6M-OsPSY1与细菌脱饱和酶CrtI联合可克服该限制，使成熟水稻种子积累类胡萝卜素。

主要关键技术方法：研究人员以Oryza sativa cv. Bomba成熟合子胚（由Illa de Riu, Tarragona, Spain提供）为转化受体。依据Nipponbare参考序列设计并合成含六个恢复基序的6M-OsPSY1启动子，与PSY1编码序列融合；另构建由barley D-hordein启动子驱动的CrtI载体和Ubi-1驱动的hpt选择标记。采用粒子轰击和潮霉素选择获得转基因愈伤及植株；通过构建体特异性PCR、定量逆转录PCR（qRT-PCR）、超高效液相色谱-光电二极管阵列（UPLC-PDA）和高效液相色谱-光电二极管阵列（HPLC-PDA）检测类胡萝卜素，气相色谱-质谱（GC-MS）与主成分分析（PCA）分析初级代谢物，亚硫酸氢盐PCR测序结合TA克隆分析启动子甲基化。

转有6M-OsPSY1和pHord-CRTI构建体的水稻转化：研究人员将6M-OsPSY1启动子与PSY1编码区组合，将细菌CrtI与barley胚乳特异D-hordein启动子组合为pHord-CRTI，并引入hpt选择标记。PCR检测显示，10个独立转化事件来源的愈伤系（2、4、24、25、25-B、26、27、28、30和35）同时携带两个转基因；line 1仅携带pHord-CRTI，作为单盒对照。

PSY1和CrtI mRNA在愈伤组织中的积累：qRT-PCR检测中，PSY1 assay检测内源OsPSY1位点和引入6M-OsPSY1拷贝的总PSY1转录本；WT Bomba愈伤有低基础信号。PSY1转录水平在24、25-B和35显著高于WT，在1、2、4、25、26、28和30无显著差异；26、28和30较WT增加超过三倍但未达统计显著。CrtI在WT未检测；2和4的Cq约35，低于可靠检测限；line 1虽有pHord-CRTI但CrtI转录也低于可靠检测限；CrtI mRNA在24、25、25-B、26、28、30和35可靠检测。line 25因橙色愈伤被选，PCR确认双盒，尽管PSY1转录相对低。

转有6M-OsPSY1和pHord-CRTI盒的愈伤组织类胡萝卜素含量：许多转化愈伤呈深橙色。cis-phytoene在24（90.61 μg g^-1 干重（DW））、25-B（63.00）、26（39.89）和28（24.06）高于WT（19.05）。总类胡萝卜素最高的系呈明显橙色。line 1和25积累较低β-胡萝卜素、α-胡萝卜素和紫黄质；line 1分别为7.77、6.25和3.00 μg g^-1 DW，line 25为14.58、7.68和7.37。β-胡萝卜素最高为24（304.39）、25-B（287.03）、26（237.57）和28（223.92），其次35（137.17），30较低（42.31）。lutein和trans-phytoene与WT相近。单盒对照未显著积累。探索性相关分析显示，β-胡萝卜素和总类胡萝卜素与PSY1转录丰度正相关（Spearman’s ρ = 0.75，p = 0.052），与CrtI无正相关（ρ = –0.29，p = 0.535）；类胡萝卜素积累未与转录丰度成比例。

再生植株的类胡萝卜素含量和代谢谱：从高β-胡萝卜素愈伤系24、25-B、26和28再生植株；30和35未再生。26和25-B的T₀植株不育，24和28的若干植株可育结种。line 24的T₁种子淡黄，line 28尤其28-3种子浅橙；28-2同一T₀植株产生颜色分离的T₁种子，分为浅黄、橙和粉三个表型类别，为同一28-2后代池化种子分级。UPLC显示WT种子无β-胡萝卜素，所有转基因种子和表型分级均积累β-胡萝卜素，最高为28-3（3.57 μg g^-1 DW）和28-2 Orange（2.42），其次24（1.72）、28-2 Pink（1.12）和28-2 Light Yellow（0.99）。所有系积累低水平phytoene，24最高（0.44），28-2 Orange最低（0.24）；phytofluene仅在24和28-2 Light Yellow低水平检测。GC-MS与PCA显示，极性代谢物在基因型间清晰分离，PC₁解释53.1%变异，PC₂解释17.2%；类胡萝卜素积累系主要沿PC₁与WT分开，并与三羧酸循环（TCA）中间体、若干氨基酸、脂肪酸和甘油磷酸相关，WT与若干碳水化合物更相关；甘油酸、葡萄糖、果糖和葡萄糖酸显著减少。

单株内种子颜色变异与不同甲基化模式相关：line 28同一转化来源的T₁植株产生不同颜色种子。亚硫酸氢盐PCR测序显示，对照Nipponbare目标扩增子呈低甲基化基线，转基因种子甲基化较高。六个基序区域中，类胡萝卜素较高的28-3种子甲基化最高，而类胡萝卜素较低的28-2 Light Yellow种子甲基化较低。该结果说明类胡萝卜素表型与启动子甲基化状态之间存在关联，但未建立因果关系。

讨论与结论翻译：本研究与先前工作相比，主要机制进展在于CrtI可替代内源多个脱饱和和异构化步骤。先前6M-OsPSY1/PDS系统中PDS只能将15-cis phytoene转化为tris-cis ζ-carotene，而水稻胚乳中进一步脱饱和和异构化效率低；CrtI可将15-cis phytoene直接转化为all-trans-lycopene，从而绕过下游限制，使愈伤组织（最高304 μg g^-1 DW）和成熟种子（最高3.57 μg g^-1 DW）均积累类胡萝卜素。该β-胡萝卜素水平高于Golden Rice 1（约1.6 μg g^-1 DW），但远低于Golden Rice 2（约31 μg g^-1 DW），因此应视为概念验证，而非与高类胡萝卜素水稻品种竞争。愈伤组织高于种子提示组织环境、质体分化、脂质储存、合成/降解/隔离平衡及发育调控染色质结构等影响。初级代谢变化中，果糖、葡萄糖、甘油酸和葡萄糖酸显著下降，这些代谢物与磷酸戊糖和糖酵解生成甘油磷酸和丙酮酸相关；丙酮酸是MEP途径前体，提供GGPP。柠檬酸和顺乌头酸升高及甘油磷酸相关代谢变化可能与前体供应和脂质关联代谢有关，但数据未建立前体代谢向类胡萝卜素合成因果重定向。转录与代谢不成比例，β-胡萝卜素和总类胡萝卜素与PSY1转录正相关但p=0.052略高于常规阈值，与CrtI无正相关；异戊二烯代谢的汇容量、底物竞争、反馈调节和亚细胞隔离可缓冲代谢物水平。转录在愈伤测，甲基化和表型在种子测，不能直接检验甲基化–PSY1表达–类胡萝卜素因果关系。line 28同转化事件种子出现多种颜色，无DNA差异证据，启动子甲基化与表型共变，但不说明因果。TA克隆前亚硫酸氢盐PCR测序使研究人员选择性评估6M-OsPSY1启动子甲基化；转基因启动子呈高甲基化，内源PSY1低甲基化。植物甲基化不一定意味转录抑制，某些甲基化DNA可形成允许染色质或活跃状态，但因未在同一种子材料中测PSY1转录，甲基化的转录后果不能确定。不同甲基化状态倾向于与类胡萝卜素积累变化一致，但样本量小且系统复杂，解释需谨慎；CpG甲基化常与启动子转录抑制相关，CHG和CHH甲基化更常与RNA指导的DNA甲基化通路和转座子相关染色质状态相关。真正SLEEPER策略最终需原位编辑内源水稻位点，而非使用再激活启动子–基因盒或异源途径组分。PSY1不是简单单基序开关；四基序可驱动报告基因，六基序才能生产性表达PSY1编码序列，说明顺式元件多重性和组合组织关键。无CrtI时，胚乳类胡萝卜素合成需协调再激活多个内源基因（包括PSY1、PDS、ZDS、Z-ISO、CRTISO和LCYB等）以及前体供应、隔离和稳定相关基因；需系统调查这些基因启动子中的不完全或近错配胚乳相关元件并进行单编辑和组合编辑验证。转录和蛋白稳定性也是限制；GFP构建体表现较强可能部分反映报告转录本和蛋白稳定，而PSY1等类胡萝卜素途径酶受转录后、翻译后和代谢反馈网络影响。因此启动子再激活不一定转化为持续途径通量，除非转录积累、酶稳定性、前体供应、质体分化和类胡萝卜素隔离与胚乳发育环境兼容。该研究证明途径可解锁，但启动子激活本身不足以高水平积累。总体而言，真正的SLEEPER基、无转基因水稻胚乳类胡萝卜素途径是长期目标，但实际实施需协调编辑多个内源启动子、验证各靶基因不完全顺式元件、选择适当且组织限制表达启动子等位基因，并优化下游储存、分支点控制和稳定性；本研究应视为证明水稻胚乳潜在类胡萝卜素途径活性可被唤醒的概念验证，而非最终生物强化策略。未来可能需要迭代启动子工程结合提高酶活性的编码序列编辑，而非仅校正PSY1。

结论翻译：总之，研究表明，恢复引入的PSY1启动子中的顺式作用调控基序，并结合CrtI赋予的增强脱饱和酶能力，足以激活水稻愈伤组织中的类胡萝卜素生物合成，并在胚乳中以较低程度激活。这与研究人员先前的6M-OsPSY1/PDS系统形成对比，在该系统中类胡萝卜素积累仅限于愈伤组织，并支持CrtI能够克服水稻胚乳中下游途径限制的结论。在愈伤组织中，PSY1/CrtI转录本丰度与类胡萝卜素积累之间的关系并非简单成比例，表明额外的代谢和发育约束影响途径输出。不同的启动子甲基化状态与β-胡萝卜素积累不同的种子表型相关；然而，这些数据未建立甲基化、PSY1表达与类胡萝卜素积累之间的因果关系。未来需要整合内源启动子编辑与匹配的种子阶段表达和甲基化分析的工作，以确定启动子甲基化是否在途径输出中发挥功能作用。