长读长测序（LRS）解析转录组复杂性：从异构体解析到多组学整合的端到端实施路线图

《iMeta》：Deciphering transcriptome complexity via long-read sequencing

　　

转录组学正从基因水平定量（gene-level quantification）转向对可变剪接（alternative splicing, AS）、转录本结构变异（transcript structural variation）和重复序列来源转录（repeat-derived transcription）的异构体解析（isoform-resolved）式探究。然而，短读长测序（short-read sequencing）在准确重建全长转录本和解析包括转座元件（transposable elements, TEs）在内的复杂重复区域方面仍存在内在局限。长读长测序（long-read sequencing, LRS）的最新进展，以Pacific Biosciences（PacBio）和Oxford Nanopore Technologies（ONT）为代表，为直接观察完整RNA分子并由此克服这些瓶颈提供了变革性机遇。然而，实际采用受到严苛文库构建（library construction）以及处理噪声大、快速演进的长读长数据需求所阻碍，该领域仍缺乏统一资源指导研究人员完成整个实验和分析工作流。本综述通过提供简洁、端到端且面向实施的长读长转录组学路线图填补这一空白。研究人员提炼了从平台和文库策略选择到核心计算处理及下游解读的关键决策，并总结了新兴前沿和最佳实践建议。通过提供可复用框架和实用检查清单，该指南赋能更广泛群体利用长读长实现标准化、可重复、异构体水平发现，达到前所未有的分辨率。

INTRODUCTION
转录组学正从基因水平定量转向异构体解析，短读长RNA测序（RNA-seq）虽可稳健定量基因表达，但难以重建全长转录本、解析重复区域和转座元件（TEs）来源转录。长读长测序（LRS）通过跨越数kb或全长RNA分子直接观察外显子连接、转录本边界和复杂结构，并支持直接RNA测序（DRS）、TE转录、融合转录本和多组学。PacBio和ONT推动发展，其他纳米孔平台扩展选择；但建库和数据处理复杂，且缺乏统一资源。

TECHNOLOGIES: PLATFORMS, PROTOCOLS, AND PERFORMANCE CHARACTERISTICS
Long-read sequencing platforms：除PacBio和ONT外，多个新兴纳米孔平台出现，但性能多需独立评估。
Pacific Biosciences：PacBio单分子实时（SMRT）测序采用零模波导（ZMW）和SMRTbell环状模板；CLR读长长而错误率高，HiFi通过环形一致性测序（CCS）获得高准确度，Iso-Seq用于全长转录组。
Oxford nanopore technologies：ONT监测核酸通过纳米孔时的离子电流变化，依赖孔蛋白和马达蛋白；转录组策略包括cDNA测序和DRS，PCR-cDNA为主流。
Other long-read sequencing platforms：QitanTech、CycloneSEQ、Axbio、Geneus、Roche SBX和Element LoopSeq等拓宽仪器选择，但长度、准确度和通量多来自厂商或早期研究。
Library preparation strategies：建库决定全长捕获完整性，需RNA稳定、质控，并选择全长cDNA或直接RNA路径。
Full-length cDNA generation：SMART利用模板转换富集全长cDNA；PacBio Iso-Seq将cDNA转为SMRTbell；ONT PCR-cDNA包括RT/链转换、PCR和快速接头连接。
Direct RNA sequencing：ONT DRS直接测序天然RNA，保留修饰，依赖poly(A)尾，3′–5′方向导致5′端覆盖丢失，需更多RNA。
Enrichment strategies: From end integrity to targeted capture：TeloPrime和CapTrap-seq富集完整5′帽；PAIso-seq、FLAM-seq和Nano3P-seq关注poly(A)尾；TEQUILA-seq等靶向捕获提高目标灵敏度。
Performance characteristics and optimization strategies of RNA sequencing
Length：LRS读长显著增加，但cDNA建库偏短，DRS中位读长约0.8–1.3 kb且5′信号丢失；新兴平台末端覆盖待评估。
Accuracy：PacBio HiFi共识准确度达99.9%，Iso-Seq约98%；ONT历史错误率高，R10.4后改善但单读仍逊于HiFi；R2C2可提高ONT cDNA共识准确度至94%，DRS RNA004结合Dorado中位准确度达98.67%。
Throughput：ONT MinION、GridION和PromethION覆盖低中高通量；PacBio从RS升级至Revio/Vega，单SMRT Cell产6–8百万HiFi reads。Kinnex/MAS-ISO-seq提高八倍通量；约10百万长读可恢复80%已知isoform，20百万长读用于准确量化。

BIOINFORMATICS METHODS: FROM RAW SIGNALS TO TRANSCRIPTS
Data preprocessing: Basecalling, quality control, and error correction
Basecalling：ONT将电流信号解码为序列，采用CNN/RNN/Transformer和Dorado等；PacBio通过CCS生成HiFi，DeepConsensus改进共识。
Quality control：质控包括产量、读长、质量、GC和接头污染；PacBio关注FLNC，ONT关注运行摘要，工具包括LongQC、LongReadSum、NanoPack2、MinKNOW、pycoQC和fastplong。
Error correction：长读错误富集插入缺失；混合校正利用短读，自校正仅用长读，UMI可分子级纠错；等位基因分析中校正需谨慎。
Identification and quantification of gene transcripts
Read alignment：长读比对需剪接感知和indel容忍；minimap2常用，Graphmap2、deSALT和uLTRA改善小外显子或边界；2passtools、Splam和FLAIR-correct可校正剪接。
Transcript identification：识别分参考引导和de novo，算法含图、聚类和分类；StringTie3、IsoQuant、FLAIR、Bambu、TALON和FLAMES常用。
Transcript quantification：量化核心是isoform共享外显子导致的可识别性；概率模型常用EM，如Salmon、RSEM、kallisto、LIQA和miniQuant；混合长短读兼顾结构与深度，SQANTI3和TUSCO用于后处理QC。
Identification and quantification of transposable element-derived transcripts：TEs占人类基因组近半，分Class I和Class II；量化受插入多态、多映射和TE-基因嵌合影响。长读插入检测包括TLDR、xTea和sTELLeR；LongTEQuant在转录本水平区分TE-alone、TE-gene和gene-alone。

TRANSCRIPTOME COMPLEXITY: NOVEL INSIGHTS FROM LONG READS
Alternative splicing：长读跨多个外显子直接观察连接和协同剪接，DRS保留天然RNA特征；分析分事件级和isoform级。
Alternative transcription start site：ATSS产生不同5′端并影响稳定性、翻译和调控；长读连接5′至3′，但需NAGATA、LoRTIA及CAGE等验证。
Alternative polyadenylation：APA产生不同3′端并改变UTR调控；长读可连接poly(A)位点与isoform，工具包括APALORD、LAPA或isoform-aware流程。
Poly(A) tail length：DRS可在同一分子估计poly(A)尾长，Nanopolish、tailfindr和Dorado常用；非A残基可用Ninetails分析。
Circular RNA：circRNA由反向剪接形成；长读可跨越整个circRNA，CIRI-long、circFL-seq和isoCirc等用于识别，定量常需短读锚定。
Fusion gene：融合基因可由读通、结构重排和TE介导等产生；长读捕获断点跨分子，LongGF、JAFFAL、Genion、FusionSeeker和CTAT-LR-fusion等用于检测。
Allele-specific expression：ASE分析受益于长读跨多个杂合变异，可定相isoform至单倍型；longcallR、LORALS、RPVG、isoLASER和FLAIR2等支持分析。

DOWNSTREAM ANALYSES: FROM TRANSCRIPTS TO BIOLOGICAL INSIGHTS
Differential transcript expression：DTE检验特定isoform绝对丰度差异；短读用概率分配，长读直接定量，混合策略兼顾结构准确性和统计功效。
Differential splicing：DS检验局部剪接构型变化；长读定义高置信事件空间，短读或IsoTools 2.0用于稳定定量。
Isoform switching：Isoform转换指优势isoform或关键isoform对使用改变；IsoformSwitchAnalyzeR、tappAS和Biosurfer用于切换识别和功能后果注释。
Isoform-specific regulatory network：以isoform为节点可揭示UTR介导的miRNA/RBP调控差异；方法包括共表达、序列预测和多组学QTL，需区分预测与证据支持。
Function prediction：功能预测注释ORF、NMD、结构域、信号肽和跨膜区；IsoformSwitchAnalyzeR、tappAS和Biosurfer常用，蛋白水平结论需Ribo-seq或蛋白质组支持。
Visualization：可视化应展示全长isoform路径、使用差异、剪接连接和末端异质性；IGV用于证据检查，Swan、IsoVis和isoespy用于呈现和报告。

CHALLENGES AND FRONTIERS
Challenges: Library preparation, accuracy, throughput, and cost
Library preparation: Capturing the full-length transcriptome：全长捕获受逆转录持续合成、模板转换、片段选择和FFPE样本限制；需工程化逆转录酶、RNA二级结构处理和微流控等改进。
Accuracy: Base-level errors and transcript-structure fidelity：准确性涉及碱基、剪接连接、外显子链和定量稳定性；PacBio HiFi为金标准，ONT错误更依赖上下文，需标准参考材料。
Throughput: Usable molecular evidence rather than nominal yield：通量应以可用分子证据而非名义Gb衡量；PacBio受ZMW数限制，ONT依赖活性孔；Kinnex、靶向捕获和自适应采样可缓解。
Cost: Declining but still a barrier for individual laboratories：成本应视为端到端投入；LRS每Gb仍高于NGS，提高可用产出、多重、靶向和混合设计可降低成本。
Challenges: Availability and performance of emerging LRS platforms：新兴平台主要部署于部分地区，缺乏公开第三方数据、专用建库试剂和成熟碱基识别工具，需独立基准。
Challenges: Scalability, transcriptome complexity, and reference annotation：大规模研究需权衡Join & Call和Call & Join；isoform扩张需困惑度等指标；参考注释如GENCODE、MANE需平衡完整性和可用性。
Challenges: Standardization of bioinformatics methods：工具爆炸导致不可重复、方法选择困难和临床转化受限；需基准数据、统一质量指标、社区挑战、模块化工作流、模型卡和AI整合。
Frontiers: Long-read single-cell transcriptomics：长读单细胞将分析推进至isoform水平；液滴法适合高通量，板式法适合高覆盖。barcode回收较稳，UMI回收受长读错误挑战，Longcell和UMI-nea等改进；已用于发育、癌症和脑研究。
Frontiers: Long-read spatial transcriptomics：长读空间转录组保留空间坐标并解析全长isoform；Spl-ISO-Seq、Spl-ISO-Seq2和Fullscope-seq提升分辨率；spot多细胞来源仍是挑战，SpotGLM可细胞类型分辨推断。
Frontiers: Direct detection of RNA modifications：DRS直接检测天然RNA修饰，覆盖m⁶A、m⁵C、Ψ、m⁷G和m¹A等；EpiNano、m6Anet、NanoPsu、CHEUI、DeepEdit和ORCA等方法扩展，但仍缺金标准和系统基准。
Frontiers: Long-read multi-omics integration：长读多组学从同一材料甚至同一分子获得多层面信息；基因组T2T、表观MeSMLR-seq、SMAC-seq、nanoNOMe、Fiber-seq、DiMeLo-seq，转录/表观PORE-cupine、nanoSHAPE，蛋白纳米孔及长读蛋白质组学推动统一框架。
CONCLUSION：LRS将转录组学从基因水平定量推向isoform解析，直接测量外显子连接、转录本边界及重复区域转录；综述连接实验设计、平台选择、建库、富集、通量-准确度权衡与计算分析。成本、低丰度事件有效深度、平台/流程偏倚和标准化不足仍限制常规和临床转化。