《Archives of Insect Biochemistry and Physiology》：Integrated Transcriptomic and Physiological Analyses Reveal Disruption of Digestive Homeostasis Induced by Protease Inhibitors in Anticarsia gemmatalis Caterpillars
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中文摘要翻译
蛋白酶抑制剂（PIs）是一类有前景的生物活性化合物，可用于可持续害虫防治，因为它们能够干扰植食性昆虫的消化过程。然而，昆虫对天然和合成PI的适应机制仍不清楚。本研究采用整合转录组学、生物化学和组织学方法，辅以探索性的宏转录组学分析，研究了黎豆夜蛾
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蛋白酶抑制剂（PIs）是一类有前景的生物活性化合物，可用于可持续害虫防治，因为它们能够干扰植食性昆虫的消化过程。然而，昆虫对天然和合成PI的适应机制仍不清楚。本研究采用整合转录组学、生物化学和组织学方法，辅以探索性的宏转录组学分析，研究了黎豆夜蛾（Anticarsia gemmatalis Hübner，鳞翅目：裳蛾科）中肠对大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂（SKTI）和合成三肽GORE-2的响应。RNA-seq分析鉴定出2542个独特的差异表达基因（FDR校正p < 0.05，|log2FC| ≥ 1），包括消化蛋白酶和氧化还原相关通路的广泛调控。SKTI诱导了一种代偿性反应，其特征是丝氨酸蛋白酶、抗氧化酶和解毒相关通路的上调。相比之下，GORE-2则导致了更广泛的消化蛋白酶抑制，包括糜蛋白酶和胰蛋白酶相关转录本以及基质金属蛋白酶，同时伴随着独特的抗氧化反应。生化测定显示，两种处理下过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）、过氧化物酶（POX）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性均升高。与SKTI相比，GORE-2诱导了较低的POX、GST和SOD活性，而CAT活性在两种处理间无显著差异。组织学分析显示，幼虫中肠出现了明显的上皮细胞破坏、空泡化和纹状缘紊乱，其中GORE-2暴露组的病变评分显著更高。从全中肠RNA-seq数据中恢复的肠道相关微生物转录本的探索性分析揭示了分类学多样的微生物信号，这些信号与碳代谢、蛋白水解和解毒作用相关。然而，在推定的细菌转录本中未检测到与处理相关的差异表达。这些发现表明，与SKTI相比，GORE-2对中肠消化和保护功能的破坏更为广泛，其抗氧化酶诱导较弱，组织学损伤更显著，这与黎豆夜蛾幼虫生理补偿能力的降低相一致。这些结果强调了基于合成肽的蛋白酶抑制剂在干扰农业重要害虫适应性消化过程中的潜力。
论文解读文章
研究背景与科学问题
黎豆夜蛾（Anticarsia gemmatalis）是巴西等大豆主产区的一种主要害虫，可导致严重的经济损失。尽管生物杀虫剂和有机杀虫剂有效，但综合害虫管理（IPM）策略仍依赖化学农药或转基因作物，这导致了抗药性种群的出现以及对非靶标生物和环境的负面影响。因此，亟需开发选择性、可生物降解且环境友好的新型害虫防治分子。蛋白酶抑制剂（PIs）因其天然、环境非持久性和靶标特异性成为有前景的候选物。它们通过与昆虫肠道内的消化蛋白酶相互作用，减少蛋白质水解和营养吸收，从而影响幼虫发育。然而，植物源大分子PI（如大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂，SKTI）易被昆虫蛋白酶水解，且许多鳞翅目昆虫能表达不敏感的同工酶以产生适应性。为克服这一障碍，研究人员设计合成了三肽GORE-2，旨在特异性地靶向黎豆夜蛾肠道胰蛋白酶样蛋白酶的催化三联体。此前研究已确立了SKTI和GORE-2对幼虫存活和发育的影响，而本工作则聚焦于阐明幼虫中肠在PI暴露早期发生的分子和生理机制。
研究方法概述
为探究上述机制，研究人员采用了整合多种技术手段的策略。首先，通过RNA测序（RNA-seq）进行转录组学分析，以鉴定差异表达基因（DEGs）。其次，运用生物化学方法测定四种关键抗氧化和解毒酶——过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POX）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性。第三，利用光学显微镜对中肠组织进行组织学评估和半定量评分。此外，还进行了探索性的宏转录组学分析，以调查肠道相关微生物的潜在贡献。实验所用黎豆夜蛾幼虫来自巴西维索萨联邦大学昆虫实验室，取五龄幼虫分别喂食对照饲料、含0.12%（w/w）SKTI或0.12%（w/w）GORE-2的人工饲料，24小时后收集其中肠用于后续分析。每个处理设置三个独立的生物学重复，每个重复由五个中肠混合而成。
主要研究结果
3.1 组织学评估
通过光学显微镜观察发现，对照组幼虫中肠上皮形态完整，具有清晰的纹状缘。而SKTI处理组幼虫中肠表现出明显的细胞质空泡化和纹状缘紊乱。GORE-2处理组幼虫的这些改变更为严重，显示出强烈的空泡化和显著的纹状缘破坏。半定量评分证实，GORE-2暴露组的病变评分显著高于SKTI组。
3.2 抗氧化酶活性
生化测定结果显示，两种PI处理均触发了抗氧化防御系统的激活。CAT活性在两个处理组中均比对照组升高约四倍，且两组间无显著差异。POX、GST和SOD活性在两种处理下也均显著升高，但SKTI诱导的活性增强幅度普遍大于GORE-2。例如，SKTI诱导的GST活性约为GORE-2诱导活性的1.7倍。这表明SKTI引发了更强的抗氧化反应，而GORE-2诱导的补偿性抗氧化防御较弱。
3.3 数据分析、测序与转录组组装
RNA-seq产生了高质量的测序数据，从头组装获得了51,825个转录本，平均长度为2243.6 nt，N50为3246 nt。这些转录本被聚类为42,372个Unigenes，其中85.69%的读数能比对到组装转录本上，验证了组装的可靠性。
3.4 功能注释
功能注释结果显示，约50%的Unigenes获得了功能注释，其中家蚕（Bombyx mori）和黑脉金斑蝶（Danaus plexippus）提供了约70%的最佳匹配。最常见的酶类别是水解酶、转移酶和氧化还原酶。胰蛋白酶样酶（KO1312）是最常遇到的编码序列，共出现145次。
3.5 差异表达基因（DEGs）分析
共鉴定出2542个独特的DEGs。SKTI处理导致1507个基因表达改变（914个上调，593个下调），而GORE-2处理影响了1736个基因（984个上调，752个下调）。两者共享701个DEGs，表明存在部分重叠的应激或防御通路。在消化蛋白酶方面，SKTI主要诱导了丝氨酸蛋白酶（包括碱性胰蛋白酶和糜蛋白酶）、羧肽酶和氨肽酶的上调，呈现出一种代偿性反应。相反，GORE-2则引起了更广泛的消化蛋白酶抑制，包括多种糜蛋白酶、胰蛋白酶、基质金属蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶的下调，同时上调了一些与线粒体和细胞应激相关的蛋白酶。
3.6 宏转录组学分析
宏转录组学分析显示，在中肠转录组中，节肢动物来源的序列占主导（~85%），而细菌序列约占7%。细菌群落以伯克霍尔德氏菌目（Burkholderiales）、噬几丁质菌目（Chitinophagales）等为主。属水平上，诺卡氏菌属（Nocardioides）和噬几丁质菌属（Chitinophaga）丰度最高。
3.7 肠道相关细菌功能角色的宏转录组学见解
对细菌转录本的功能注释表明，这些微生物参与了中心碳代谢（如糖酵解、TCA循环）、氨基酸和脂质代谢等过程。细菌蛋白酶约占所有微生物转录本的7%，其中胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶最为丰富。然而，比较分析未检测到细菌基因在SKTI或GORE-2处理后发生显著的差异表达，表明在本研究的分析框架下，细菌组分在转录水平上相对稳定。
讨论与结论总结
讨论部分指出，研究结果表明PI的生理效应远超简单的消化抑制。SKTI诱导的代偿性反应（蛋白酶上调和强抗氧化酶激活）符合植食性昆虫对植物源抑制剂的经典适应模式。而GORE-2则造成了更严重的生理负担，它同时损害了消化和保护功能，表现为消化酶的广泛抑制、较弱的抗氧化响应以及更严重的中肠上皮损伤。这种较弱的抗氧化补偿可能不足以抵消消化紊乱引起的氧化应激，从而导致活性氧（ROS）积累和上皮结构破坏。研究结论强调，GORE-2与更广泛的消化蛋白酶抑制、减弱的抗氧化激活和更高的组织学病变评分相关，这与其降低的生理补偿能力和/或增加的细胞毒性应激一致。尽管肠道微生物组在分类学和功能上呈现多样性，但在本研究中未检测到其对PI处理的转录响应。总体而言，研究结果确定了宿主消化、氧化还原和组织学反应是主要的处理敏感性组分，并支持GORE-2作为一种有前景的肽骨架用于未来开发选择性害虫控制策略。
