《International Journal of Genomics》：Metagenomic Tools as Predictive Approaches to Decipher Soil and Rhizosphere Microbial Communities and Their Functions for Sustainable Agriculture
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日益增长的对于具有韧性和可持续性的粮食生产需求，要求我们全面理解根际微生物群落及其在促进植物健康、养分获取、抗逆性和作物生产力方面的功能作用，从而支撑粮食安全与可持续农业。然而，土壤微生物组由复杂且不可培养的有益微生物群落组成，这些微生物驱动着关键的生态系统功
日益增长的对于具有韧性和可持续性的粮食生产需求，要求我们全面理解根际微生物群落及其在促进植物健康、养分获取、抗逆性和作物生产力方面的功能作用，从而支撑粮食安全与可持续农业。然而，土壤微生物组由复杂且不可培养的有益微生物群落组成，这些微生物驱动着关键的生态系统功能，而传统的培养方法无法捕捉这些功能，这限制了我们对其在植物健康和农业可持续性中作用与影响的理解。宏基因组工具（metagenomic tools）已成为表征土壤微生物多样性的变革性方法。因此，本综述概述了如何利用宏基因组技术来预测微生物群落结构及其相关的功能潜力，最终为发展具有韧性的耕作策略作出贡献。下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）与生物信息学使得宏基因组学能够分析土壤和根际中的微生物遗传物质。本研究提供了对微生物多样性的见解，以及与养分可利用性和土壤功能相关的关键功能基因图谱。我们讨论了利用宏基因组工具预测土壤健康与微生物功能以服务于可持续农业生态系统，并强调了有助于农民优化产量和最小化环境影响的预测模型。本综述探讨了宏基因组工具如何作为预测模型，转变我们对土壤—微生物互作的理解。这一进展可促进新型、更具韧性、生产力和可持续性农业系统的形成。
1. 引言
土壤和根际微生物组日益被认为是植物健康、养分循环和韧性农业的基础组成部分。根际是由根系沉积物及相关微生物深刻塑造的受限土壤区室，支持着包括病毒、细菌、古菌和真菌在内的多元化有益微生物联合体。这些微生物种群与植物发生多种互作，促进生长、增强胁迫耐受性和养分介导，对植物发育至关重要。研究表明，这些有益根际微生物能够执行多种功能，包括磷酸盐溶解、将大气氮（atmospheric nitrogen, AN）转化为可利用形式，以及植物生长激素的合成。同样，它们通过竞争和分泌抗菌物质来抑制有害土壤生物。然而，微生物群落的多样性和功能对植物健康及更广泛的生态系统功能（包括维持土壤结构、有机物分解和养分循环）不可或缺。已有研究发现，根际微生物组的组成受植物基因型、土壤类型和环境条件的影响。尽管如此，某些功能性状（如固氮和病害抑制）在不同系统中常常是保守的，这种功能冗余对于确保关键生态系统过程的持续存在至关重要，即使土壤群落组成因施肥等环境变化而发生改变。
尽管具有关键重要性，传统微生物学方法（如依赖培养的技术）在全面表征土壤和根际微生物组的多样性与功能方面面临挑战。依赖培养的技术需要微生物的体外增殖，通常只能获取土壤生态系统中整个微生物群落的不到2.5%。许多土壤微生物表现出难以培养的特性，而那些能在实验室条件下生长的微生物未必代表群落中功能上最重要的成员。这一限制历来阻碍了阐明微生物间互作及其增殖以促进植物生产和健康的全貌。高通量测序技术（如鸟枪法宏基因组学）的出现极大地改变了土壤和根际微生物组的研究。宏基因组方法（如鸟枪法测序）使科学家能够在无需培养的情况下检查环境样本中微生物群落的整个基因库，从而消除了培养需求。该方法促进了先前未表征微生物类群的鉴定，并阐明了其与养分循环、抗病性和促进植物发育相关的功能多样性。它还帮助描绘了与植物生长和发育相关的微生物代谢途径，从而为微生物组工程和可持续农业实践提供了新的靶点。
此外，下一代测序（NGS）促进了预测建模和微生物组策略性调控的进展。通过将宏基因组数据集与网络分析和机器学习模型整合，科学家能够识别支撑有益植物—微生物互作的关键微生物类群和功能。这一进展促进了生物接种剂和土壤改良剂的开发，这些产品旨在招募或增强有益微生物群落，从而提高作物生产力和韧性，同时减少对化学投入品的依赖。在极端环境（如干旱农业系统）中，宏基因组研究揭示了高度的微生物种群和功能多样性。关于可持续发展目标（SDG）2（零饥饿），宏基因组学的应用通过采用旨在提高农业生产力、土壤健康和耕作实践可持续性的微生物技术，显著增强了粮食生产。该方法促进了有益微生物的鉴定，这些微生物可用于生物肥料和生物农药的配制，从而在减少对有害化学制剂依赖的同时提高作物产量。同样，宏基因组学通过促进全面的环境监测，构成了追求SDG 13（气候变化研究）的关键组成部分。这一能力允许全面收集数据，有助于制定旨在减轻气候变化影响、环境监测和增强生态系统韧性的适应性策略。
因此，本综述探讨了利用宏基因组学描绘土壤和根际微生物群落及其在可持续农业中作用的研究。本研究强调了用于预测微生物组成、多样性和功能的现代技术，重点阐述了它们对植物健康、养分循环、抗病性和胁迫耐受性的益处。本综述讨论了宏基因组数据与传统农业的整合以及未来研究，包括机器学习在改善可持续农业和土壤健康方面的应用。
2. 根际微生物群落：组成、多样性与功能动态
2.1 根际微生物多样性与群落组成
根际微生物群落是土壤环境中最复杂且对作物生产力具有强预测能力的群落之一，在植物健康、养分循环和农业生态系统可持续性方面发挥着关键功能。根系分泌物（如糖类、氨基酸和有机酸）以及根际相关微生物（细菌、真菌和古菌）直接影响根际，成为微生物活动和功能的焦点。这一现象以植物根系、矿质养分（如氮输入）与根际栖息的各种有益微生物群之间的强烈互作为特征，每个群体对土壤功能和植物表现都有独特贡献。根际内微生物群落的结构进一步受作物种类、土壤性质、农业管理措施和生态因素的影响。通常，细菌是数量最多且占主导地位的群体，包括厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria）等门类，在不同作物和环境中经常被报道。真菌（包括丛枝菌根真菌（AMF），如Claroideoglomus claroideum、Claroideoglomus etunicatum、Claroideoglomus luteum和Rhizophagus irregularis）作为养分吸收和作物韧性的关键介导者，而其他真菌类群（如Trichoderma afroharzianum和Trichoderma longibrachiatum）则促进有机物分解和病害抑制。古菌虽然多样性较低，但对氮循环（尤其是氨氧化）很重要，其丰度受土壤pH和养分状况影响。然而，病毒虽然研究较少，但已被证明可调节微生物种群动态并促进与不同宿主生态位分化和代谢策略相关的动态活性模式，间接影响植物健康和土壤功能。在这些分类群中，存在执行与植物生长相关功能的类群，包括能够固氮的细菌（如Bradyrhizobium和Azospirillum属），它们将大气氮转化为可吸收状态，以及溶解磷酸盐的细菌（如Pseudomonas和Sphingomonas），提高磷酸盐的可利用性。促进植物生长的根际细菌（PGPR），包括Bacillus和Enterobacteria属，不仅促进养分获取，还产生植物激素、抑制病原体并提高植物对环境胁迫的耐受性。这些有益微生物的丰富度和丰度对于维持土壤健康和支持可持续作物生产至关重要。
2.2 根际微生物组的功能作用
微生物群落是土壤中必需矿质元素（包括氮、磷、钾）转化和铁载体产生的核心。此外，细菌和真菌参与有机物分解，将碳和其他矿物质释放到土壤中。固氮细菌将大气氮转化为植物可吸收的形式，而解磷微生物（包括Aspergillus flavus）则提高磷的生物可利用性以增强植物吸收。硫氧化和硫还原微生物促进硫循环，这对植物营养和土壤健康至关重要。同样，根际中的植物和微生物参与多种多样的互作，这些互作对植物适应性可能是有益的（如互利共生或正向）、有害的（如拮抗或负向）和/或大体中性的。互利共生关系（如植物与AMF和PGPR之间）增强养分吸收、刺激植物生长并增加抗旱性。拮抗微生物（包括生物防治剂如Trichoderma spp.）抑制土传病害并保护作物免受有害生物侵害。这些互作由根系分泌物促进，根系分泌物在调节根际微生物群落进而影响植物健康方面发挥重要作用。此外，根际微生物在增强植物对非生物和生物胁迫的耐受性方面发挥重要功能。有益细菌和真菌（如Rhizobium sp.、Bradyrhizobium sp.和C. claroideum）的联合接种通过产生和/或调节植物激素水平、产生保护性化合物（如抗氧化剂）以及改善养分获取，帮助植物抵御生物和非生物侵害。研究表明，PGPR（包括Pseudomonas spp.和Bacillus spp.）产生ACC脱氨酶，降低植物乙烯水平并帮助植物在干旱胁迫下存活。同样，AMF改善水分和养分吸收，进一步支持植物在不利条件下的韧性。
同样，古菌在根际也发挥专门作用，不同门类驱动根—土界面的关键过程。在这一狭窄区域中，奇古菌门（Thaumarchaeota）是氮循环的主要驱动者，利用专门的氨单加氧酶通过氨氧化古菌（AOA）主导硝化作用的限速氨氧化步骤。同时，属于广古菌门（Euryarchaeota）的产甲烷谱系控制碳动态，在缺氧环境（如富铁水稻土）中严格调节甲烷产生和通量。除了这些生物地球化学循环外，这两个门类还通过合成生长促进植物激素（如生长素）和产生抗氧化酶（如过氧化氢酶—过氧化物酶）来缓解宿主在恶劣环境条件下的氧化胁迫，积极支持植物适应性。最终，奇古菌门和广古菌门的代谢多功能性稳定了更广泛的土壤微生物组网络，增强了对病原体的生物抗性并提高作物韧性。
宏基因组分析揭示了几个与根际过程和植物表现具有潜在相关性的主要功能类别。碳和氮循环能力通过细菌和古菌参与有机物分解和氮转化的基因得以体现，包括用于生物固氮的nif基因、用于硝化的amoA基因以及用于反硝化的nirK/nirS、norB和nosZ基因，共同表明微生物对土壤氮周转和生物可利用氮库的积极贡献。磷 mobilization 潜力由phoA/phoD等磷酸酶基因以及* pstSCAB、phoB、phoR和phoU等磷酸盐转运和调控基因的存在所支持，这些基因在养分限制条件下参与磷酸盐清除和溶解。植物激素产生能力由色氨酸依赖的吲哚-3-乙酸生物合成基因（包括ipdC、iaaM和iaaH）所提示，这些基因已知影响根系伸长并调节植物—微生物信号传导。胁迫缓解机制由与渗透保护和一般胁迫耐受性相关的基因（包括海藻糖和甘氨酸甜菜碱生物合成基因）以及编码ACC脱氨酶的acdS*基因所指示，该酶可减弱胁迫诱导的乙烯水平，从而在不利环境条件下促进植物生长。综合来看，这些功能性状表明根际微生物组具有增强养分获取、调节根系发育和增加植物胁迫韧性的潜力。
3. 揭示微生物组功能和多样性的宏基因组方法
微生物群落研究领域因NGS技术的进步而经历了变革性转变。这些创新使研究人员能够以前所未有的精度研究微生物组的结构、多样性和功能方面。两种主要方法，扩增子测序（使用16S rRNA等标记研究细菌和古菌，以及内转录间隔区（ITS）用于真菌表征）和鸟枪法宏基因组学，构成了大多数微生物组研究的基础技术。补充这些方法的是一个快速发展的计算工具、功能分析方法和整合性多组学策略网络，共同拓展了微生物组科学的边界。
3.1 鸟枪法测序技术与扩增子测序（16S/ITS）：优势与局限的比较
扩增子测序聚焦于16S rRNA基因（作为细菌和古菌群落表征和鉴定的关键分子标记）和ITS区域（作为真菌群落的关键分子标记），一直是土壤微生物生态学的基础技术。该方法涉及通过聚合酶链反应（PCR）扩增保守的遗传标记，随后进行测序和分类学鉴定。其优势包括成本效益高、可扩展性强，以及能够在资源受限环境中对大量样本生成可靠的属水平（偶尔为种水平）分类学图谱。尽管扩增子测序有效，但具有显著局限性。该方法的主要限制与引物选择和随后的PCR扩增过程相关，这可能改变特定类群的代表性。其分类学分辨率主要局限于属水平，使得种水平鉴定常常不可靠，特别是对于系统发育相近的生物。此外，扩增子测序仅提供对功能潜力的间接推断，因为它不捕获群落内完整的基因代表性。
与针对性的扩增子测序方法相比，鸟枪法宏基因组学涉及对给定样本中所有DNA进行测序，不仅涵盖细菌和古菌DNA，还包括病毒、真菌和其他真核生物的DNA。该方法促进了具有显著更高分辨率（通常延伸至种或甚至株水平）的广泛分类学分析，并便于直接评估功能基因和代谢途径。鸟枪法宏基因组学在识别稀有或低丰度类群以及表征微生物群落功能多样性方面特别有效。然而，鸟枪法宏基因组学的局限性包括财务成本增加、计算需求增加，以及需要更深的测序工作以获得足够的覆盖率，特别是在复杂或低生物量样本中。数据分析过程更为复杂，需要强大的生物信息学流程和大量计算资源。
比较分析表明，尽管两种方法都能对细菌、古菌和真菌群落产生相似的属水平图谱，但鸟枪法宏基因组学在实现更高种水平分辨率、识别稀有类群和预测功能基因方面始终优于扩增子测序。与16S/ITS扩增子测序相比，鸟枪法宏基因组学通常提供更高的种和株水平分辨率，改进稀有和非靶标类群（包括病毒）的检测，以及更直接、更准确地预测功能基因和途径。然而，对于真菌研究，鸟枪法宏基因组学与ITS扩增子测序之间的一致性常常有限，强调需要根据具体研究目标和靶标生物选择方法。然而，鸟枪法宏基因组学并不总是优于扩增子测序，因为性能随样本类型、读取深度和分类水平而变化。有研究报告，在巴西河流样本中，扩增子测序比鸟枪法测序恢复了多27%以上的科和更多的门，这与鸟枪法测序的优越性相矛盾。其他研究报道两种方法具有相当的细菌属水平准确性，并指出鸟枪法功能分辨率的优势在富含宿主的样本中“受到微生物读取深度的强烈限制”，因此当宿主DNA丰富时，低微生物读取深度限制了功能洞察。
图1展示了扩增子测序的工作流程，该流程构成了表征微生物群落的稳健且标准化的框架，系统性地整合了湿实验室样本制备与先进的 downstream 生物信息学分析。从DNA提取和标记基因PCR扩增开始，随后进行高通量测序，该流程促进了高度靶向的数据获取。生物信息学核心包含严格的质量控制、去噪和序列聚类程序（使用FastQC、DADA2和VSEARCH等工具），以最小化PCR衍生的伪影和测序错误，从而能够生成可靠的扩增子序列变体（ASVs）或操作分类单元（OTUs）。同时，针对精选参考数据库（如SILVA、Greengenes）的分类学分配以及通过京都基因与基因组百科全书（KEGG）注释的功能推断，支持全面的双视角分析，同时解析群落组成（“谁存在”）和推定代谢潜力（“编码了什么功能能力”）。随后将这些互补的丰度矩阵整合到生态多样性指数和统计可视化工作流程中，为从复杂宏基因组数据集中提取生物学上有意义的见解提供了严格且可重复的框架。
图2示意性地描绘了采用组装优先策略的鸟枪法宏基因组学工作流程，以表征微生物群落的分类组成、功能 repertoire 和抗生素耐药决定因素。在初始质量控制获得高保真测序读数后，进行从头组装和随后的基因预测，以生成非冗余的单基因目录。该集中基因目录随后通过三个并行注释流程进行分析：一个通过Micro NR数据库进行分类学分配；另一个基于核心功能资源（使用KEGG、CAZy、eggNOG、VFDB和PHI）进行代谢和表型分析；第三个用于聚焦抗生素耐药基因和移动遗传元件（CARDs和MGEs）的耐药组分析。下游统计分析整合这些多层注释以阐明群落生态动态。特别是，物种和功能水平矩阵经受多元排序和多样性分析（NMDS、PCoA、PCA和alpha多样性指标）以及非参数和机器学习差异丰度检验（LEfSe、随机森林[RF]、MetaGenomeSeq、Anosim、iPATH），以识别实验组间的判别性生物标志物。同时，耐药组特定分支产生抗生素耐药性的聚焦表征，描绘耐药决定因素的多样性、差异丰度和推定宿主—物种关联，从而提供群落功能潜力和生物安全风险的综合评估。
3.1.1 影响土壤和根际宏基因组研究中扩增子和鸟枪法测序选择的因素
土壤和根际样本对宏基因组分析提出了直接影响测序策略的特定方法学挑战。扩增子测序（如16S rRNA、ITS）通常因以下原因被优先用于土壤群落调查：对复杂微生物组合中的微生物类群检测敏感；对大量样本集具有成本效益；以及受益于覆盖多样化土壤微生物群落的全面16S参考数据库。相比之下，鸟枪法宏基因组测序不仅检测微生物类群，还为土壤微生物组提供更高的功能分辨率（如养分循环基因和植物生长促进性状）。然而，它需要高质量的微生物DNA，并受到高有机质和腐殖质的阻碍，这些物质干扰DNA提取和测序。在土壤微生物组研究中选择扩增子方法和鸟枪法宏基因组测序取决于土壤特性和研究设计。当关注高度多样化的土壤群落（每克含数百个类群）的分类学分析时；当必须在有限预算下处理许多样本（如具有许多重复的温室试验）时；当检测低丰度类群很重要时，靶向PCR提高灵敏度；以及当存在覆盖土壤细菌良好的全面、精选标记基因数据库（如SILVA和Greengenes）时，扩增子测序（如16S rRNA和ITS）是首选。然而，扩增子测序对土壤微生物群落具有重要局限性，包括引物与未表征类群不匹配导致的PCR偏差，以及无法直接推断功能潜力（如养分循环或植物生长促进基因）。因此，当（1）功能注释是主要目标（如检测和表征生物肥料开发中的磷酸盐溶解、吲哚-3-乙酸（IAA）生物合成或固氮基因）；（2）需要株水平分辨率来区分密切相关的根际分离株；以及（3）需要高质量的宏基因组组装基因组（MAGs）用于基因组解析和比较分析时，鸟枪法宏基因组测序是首选。鸟枪法宏基因组学的主要缺点包括高有机质和腐殖质抑制文库制备和测序，以及根际样本中丰富的宿主DNA降低微生物测序深度，通常需要宿主DNA去除或微生物DNA富集。在植物—微生物互作和生物肥料效应的根际微生物组研究中，扩增子测序通常最适合广泛、成本有效的分类学分析，而鸟枪法宏基因组学在解析基因、途径和代谢水平上植物生长促进的功能机制时更受青睐。
3.2 宏基因组学分析的计算工具和流程
微生物组数据的爆炸式增长促进了广泛计算工具和分析流程的发展，每个工具专门针对不同的测序技术和研究需求。扩增子测序使用一套计算工具（流程），如QIIME2，作为模块化和可扩展平台，促进质量控制、分类学分配、多样性分析和可视化。QIIME2同时支持ASV和OTU工作流程，并提供去噪插件（包括DADA2和Deblur），以及与多个参考序列数据库（如SILVA和Greengenes）的集成。同样，Mothur是专门设计用于处理16S rRNA基因序列的成熟流程，提供稳健的聚类、嵌合体检测和分类学分析能力。DADA2是一种高分辨率去噪算法，通过推断精确序列变体增强扩增子数据的灵敏度和特异性。然而，在鸟枪法宏基因组测序中，利用几个关键计算（流程）来分析宏基因组数据。其中，MG-RAST作为自动化平台，通过使用多种参考数据库促进分类和功能注释。同样，MEGAN为广泛宏基因组数据集的交互式探索和审查提供稳健框架，实现分类和功能分类，同时与DIAMOND等高通量比对器无缝集成。同样，Kraken2以其卓越的速度作为基于k-mer的分类器而闻名，为扩增子和鸟枪法序列数据提供高精度分类学分配。此外，HUMAnN3擅长功能分析，通过将序列读数映射到基因家族和途径（通过KEGG、UniRef和MetaCyc等数据库），从宏基因组或宏转录组数据重建代谢途径。同样，PICRUSt2专为通过16S rRNA基因数据进行预测性功能分析而定制，通过将类群与参考基因组中已知基因内容相关联来推断微生物群落的潜在功能。然而，计算流程和参考数据库的选择是可能显著影响微生物组研究结果的关键因素，已记录SILVA和RefSeq/Kraken2标准文库相对于Greengenes数据库为分类学分配提供更高准确性。此外，最初为全基因组宏基因组分析开发的工具（如PathoScope和Kraken2）已证明在16S扩增子数据上表现优异，有时超越传统的扩增子中心方法。
3.3 预测性功能分析：从分类学评估过渡到功能评估
微生物组研究的主要目标是超越基本分类组成，阐明微生物群落的功能能力。预测性功能分析工作旨在通过利用分类学数据来解读基因和代谢途径的发生率，弥合这一差距。PICRUSt2、Tax4Fun2和FAPROTAX等工具通过将观察到的类群映射到参考基因组及其在eggNOG、COG（直系同源群聚类）和KEGG等数据库中的注释基因内容，促进扩增子数据的功能图谱预测。这些预测对于制定关于微生物群落功能的假设至关重要，特别是在鸟枪法宏基因组学不可行时。然而，这些预测的精度受分类学分配质量、参考数据库完整性和系统发育相似类群具有类似功能 repertoire 的假设所限制。在农业中，16S rRNA基因测序阐明了微生物多样性的组成结构，但不足以识别影响土壤肥力和作物生长的关键功能潜力或生态相关微生物组效应，需要谨慎解释。相反，鸟枪法宏基因组学涉及直接对群落内全部基因进行测序，提供了功能潜力更可靠和全面的视角。测序读数可以通过COG、eggNOG和KEGG数据库比对到基因数据库和代谢途径，促进微生物群落及其代谢和功能多样性的详细表征。该方法在与HUMAnN3等途径中心工具集成时特别有效，能够分析样本间代谢途径的丰度和完整性。
3.4 用于机器学习（AI）计算建模的多组学数据整合
在快速发展的微生物组研究领域，明显转向整合性多组学方法，不仅涵盖微生物群落的遗传潜力，还包括其动态功能以及与宿主和环境的互作。宏转录组学通过测序群落总RNA发挥关键作用，从而阐明基因表达和活跃代谢过程。该方法提供了对特定环境条件下哪些基因被活跃转录的重要理解，从而提供补充宏基因组学静态基因清单的群落功能动态视角。通过进一步将分析延伸到蛋白质水平，宏蛋白质组学通过识别和量化微生物蛋白质，促进表征微生物群落内表达的蛋白质组。宏蛋白质组学提供功能活性的直接证据，并可揭示翻译后修饰和蛋白质—蛋白质互作。几种复杂软件工具（如ProPHAnE、eggNOG-mapper、MetaProteomeAnalyzer、MetaGOmics、MEGAN和Unipept）促进宏蛋白质组数据的功能分析和比较分析，每种工具在灵敏度、特异性和功能组覆盖方面具有独特优势。同时，代谢组学分析微生物群合成或产生的代谢物（中间产物），从而提供土壤微生物组生化产物和生态影响的整体视角。然而，将宏蛋白质组学、宏基因组学、宏转录组学和代谢组学（称为“多组学”）与土壤科学相结合，能够整体理解根际微生物组的结构、功能和动态。然而，将多组学数据整合到土壤科学中带来了显著的分析障碍，包括数据标准化、降维以及需要稳健的统计和计算框架。在此框架内，计算学习算法（ML）和人工智能（AI）日益发挥核心作用。ML算法可以处理广泛的高维数据集，以识别复杂模式、识别生物标志物并预测功能或疾病结果。特别是，深度学习模型已证明在自动化特征提取、非线性关系建模和整合异构数据类型以进行农业预测方面的效率，正如在小麦产量预测研究中的应用所证明的那样。然而，AI驱动的方法已被用于通过分析微生物组图谱来预测宿主植物表型和评估土壤疾病风险。这些方法促进识别与疾病诊断相关的微生物生物标志物和检测微生物耐药基因。此外，AI驱动模型用于模拟微生物互作和群落动态。此外，这些方法能够整合多组学数据，允许详尽的功能分析。专门ML软件和框架的开发促进仔细的预处理、特征选择、模型验证和透明度，其中随机森林（RFs）、逻辑回归和个体条件期望（ICE）图等工具在土壤科学中提供预测能力和生物学见解。
3.4.1 新兴宏基因组学方法
宏基因组测序的近期进展产生了多种新方法，与常规技术相比改善了微生物群落的表征。长读长宏基因组测序采用Pacific Biosciences（PacBio）HiFi和Oxford Nanopore Technologies（ONT）技术，产生数千碱基规模的序列读数。这种增加的读长促进更连续和完整的基因组组装重建，增强重复和结构复杂基因组区域的分辨率，并改善株水平的分类学区分，特别是与常规短读长Illumina测序方法相比。第三代长读长宏基因组测序克服了异质样本中短读长平台的组装限制，正在改变农业微生物组研究。PacBio HiFi和ONT产生长（>10 kb）、连续读数，避免短读长工作流程固有的碎片化。PacBio HiFi使用环化共有序列读数达到>99.9%的准确性，匹配短读长保真度同时保持结构连续性。这使得metaMDBG和hifiasm-meta等工具能够从不可培养微生物重建完整、环状、单重叠群MAGs。长读长还解决重复区域，直接将专门的功能基因簇（如植物生长促进（PGP）操纵子和抗生素耐药基因）与其宿主生物联系起来。结合先进的DNA提取方法，这些长读长方法提供了驱动作物—根界面养分循环的多界网络前所未有的分辨率。单细胞宏基因组学（scMETAG）是另一种新兴技术，涉及复杂群落内单个微生物细胞的物理分离和基因组测序，从而绕过对批量群落DNA组装的需求。该方法促进从稀有或低丰度类群重建高分辨率基因组，这些类群在常规、群体平均的宏基因组数据集中常常代表性不足或被掩盖。scMETAG由长读长测序支持，克服了批量群落提取中细胞背景的丢失。通过微流控或液滴平台物理分离复杂样本中的单个微生物细胞，单细胞宏基因组方法在单细胞而非群落bin分辨率表征基因组。这在复杂微生物组中至关重要，因为单细胞测序难以均匀应用，因为细胞含有少量DNA，且类群在细胞壁结构和裂解要求上不同。在根际和土壤中，单细胞基因组学扩展微生物基因组目录，当与宏基因组数据结合时，揭示根区的株水平模式和动态。它对于从标准方法仍难以处理的土壤和根际平面群落获取多样化、高质量基因组特别有效。然而，单细胞技术仍受限于低封装效率、扩增偏差以及某些生物膜相关微生物回收率差。同样，高通量染色体构象捕获宏基因组学（Hi-C）将鸟枪法测序与邻近连接相结合，连接完整细胞内相邻的DNA片段，为宏基因组数据添加空间背景。该方法改善重叠群binning和基因组解析分析，因为Hi-C接触连接来自同一细胞的片段并生成指导binning的重叠群接触矩阵。在小麦根际研究中，仅短读长的binning常常导致高度污染bin，而添加Hi-C数据改善MAG质量并减少嵌合体数量。将长读长测序与Hi-C配对进一步改善MAG回收，特别是当多种binning方法结合使用而非孤立使用时。Hi-C还有助于将移动遗传元件与其宿主联系起来，因为基于邻近的接触将质粒、噬菌体和携带ARG的元件与可能宿主相关联。对于根际聚焦应用，Hi-C数据可以极大地改善基因组binning和宿主关联推断，但所得组装和关联在系统基准测试、仔细过滤并与互补测序和分析方法整合时最可靠。总之，这些方法克服了常规宏基因组学的关键限制——高度碎片化组装、密切相关菌株分辨率差以及对丰余类群的偏差——从而能够更全面地表征植物—微生物互作，更准确地评估农业生态系统中微生物功能潜力。
4. 宏基因组工具在可持续农业中的应用
宏基因组工具已成为推进农业可持续性的关键和前沿工具，提供了对土壤和植物相关微生物群落多样性、功能性、结构和组成的无与伦比的理解。这些工具促进了对环境样本遗传物质的直接测序和分析，从而绕过了传统基于培养方法的局限性。该方法揭示了对于土壤健康、植物生长和生态系统韧性至关重要的广泛微生物阵列。宏基因组学为到2030年实现SDG 2提供了稳健的科学方法，通过促进粮食安全和可持续农业的创新解决方案。这涉及开发对气候变化具有韧性的作物，增加干旱和盐度耐受性，并直接支持SDG 2消除饥饿和促进可持续农业以确保人人粮食可及的目标。宏基因组工具（如QIIME2、MG-RAST和Kraken2）在可持续农业中的利用显著增强了土壤健康监测。作为动态生态系统，土壤 harbors 一个复杂的有益微生物群落，促进养分循环、有机物分解和污染物降解。宏基因组学通过识别土壤基质（特别是土壤根际）中的分类组成和功能基因，提供了表征这些微生物群落的全面框架。同样，通过监测与土壤肥力相关的微生物指示过程（如固氮、解磷和有机物分解），研究人员和农民可以以前所未有的精度评估土壤生物质量。该方法还革新了检测土地管理实践、环境污染或气候变化引起的微生物群落变化，为土壤退化或污染提供早期指标。通过宏基因组方法获得的稳健微生物指标现在对于可持续土地管理和保护策略至关重要，因为它们确保土壤质量和生产力的可持续维护。
同样，农业中的宏基因组工具从根本上改变了生物肥料的配制，生物肥料是用于增强和改善作物发育和土壤养分状况的微生物制剂。通过分析土壤和根际生态系统的遗传物质，宏基因组学促进鉴定具有与养分矿化和固定以及产生有利于植物生长的植物激素相关性状的有益微生物，从而减少对化学肥料的依赖并减轻环境后果。此外，宏基因组学支持发现与这些有益性状相关的基因，推进生物工程和合成生物学策略，以工程化具有改进功效和定制功能的下一代生物肥料。宏基因组学与高通量筛选和其他组学技术的整合正在促进可持续、环境友好解决方案的发展，以应对日益增长的全球粮食需求。此外，宏基因组工具（如CARD（抗生素耐药基因数据库）、MetaGeneMark和HUMAnN）在生物防治和病害抑制方面提供强大潜力，用于检测参与病原体抑制的拮抗微生物和功能基因。土传病原体和害虫对作物生产构成重大风险。然而，宏基因组学能够表征与自然抗病性相关的微生物基因簇和类群，如编码抗生素、裂解酶和铁载体的基因。阐明有益微生物抑制病原体增殖的机制使研究人员能够设计有效的生物防治剂和抑病土壤改良剂，从而减少对合成农用化学品的依赖并促进农业生态系统可持续性。此外，功能宏基因组学与网络分析相结合，支持根际内有益微生物的靶向招募或增强，从而增强植物保护并促进整体生态系统健康。然而，宏基因组工具在气候智能农业中的应用正获得显著关注，特别是因为土壤微生物在碳封存、温室气体减排以及增强作物对盐度和干旱等胁迫因子的耐受性方面发挥关键作用。通过分析土壤微生物群落，研究人员可以监测参与温室气体调节的微生物（如甲烷氧化菌和反硝化菌），这些微生物对于减少农业土壤的甲烷和一氧化二氮排放至关重要。同样，宏基因组方法促进了在稳定土壤有机碳、减少温室气体排放以及提高养分和水分利用效率方面发挥作用的代谢途径的鉴定。这些见解有助于形成管理实践和干预措施，包括引入特定微生物联合体或旨在促进气候韧性和可持续性的土壤改良剂。通过宏基因组学，研究人员可以制定支持健康土壤、稳健作物生产和面对气候变化挑战的环境保护的生态系统恢复策略。可持续农业中宏基因组学的关键实施是鉴定有益微生物及其功能基因。通过使用先进的测序和生物信息学，科学家可以识别参与植物生长促进活性的新型微生物和酶，所有这些都有助于提高作物产量并减少对化学肥料的依赖。诸如PGPg_finder等宏基因组流程能够检测参与促进植物生长的功能基因，促进开发既环境可持续又针对特定作物或土壤条件定制的生物肥料和生物农药。
