肿瘤细胞膜仿生MnO2纳米平台共递送R848通过cGAS-STING通路增强乳腺癌放疗-免疫治疗

《Materials Today Bio》：Cancer-cell-mimicking MnO 2 nanoplatform delivers immunological adjuvants to enhance radio-immunotherapy

肿瘤内缺氧和免疫抑制微环境是导致放疗（radiotherapy，RT）抵抗的基本机制，并与癌症患者不良预后密切相关。为克服这些局限，研究人员构建了一种肿瘤细胞膜仿生锰基纳米平台，用于递送免疫佐剂（MnO₂-R848@CM），以协同增强临床放疗疗效。体外实验表明，MnO₂-R848@CM可被4T1细胞快速且特异性地摄取。在X射线照射下，免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，ICD）和释放的Mn²⁺激活树突状细胞（dendritic cells，DCs）中的cGAS-STING（cyclic GMP-AMP synthase–stimulator of interferon genes）通路，与R848协同加速DCs成熟，触发下游免疫应答级联。在乳腺癌小鼠模型中，MnO₂–R848@CM表现出高效的同源靶向（homotargeting）特性，在肿瘤部位快速蓄积并持续滞留。其进一步通过多条途径建立持久的适应性抗肿瘤免疫应答，有效加速肿瘤消融并显著抑制荷瘤小鼠肿瘤生长。这些发现凸显了MnO₂–R848@CM纳米平台在推进协同癌症放射免疫治疗中的潜力，该策略有效整合了放疗的直接细胞毒效应与持续抗肿瘤免疫应答。

研究背景：放疗（radiotherapy，RT）是临床应用广泛的癌症治疗方式，适用于几乎所有实体瘤。除直接细胞毒作用外，RT还可通过电离辐射促进活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生，直接损伤DNA和其他细胞器；同时可诱导免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，ICD），激活补体应答和适应性免疫应答。多种免疫治疗在临床癌症治疗中取得进展，如癌症疫苗具有成本效益高、特异性强和不良反应小等特点。RT与免疫治疗联合用于局部和转移性肿瘤受到关注。然而，肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中免疫抑制细胞和缺氧状态是主要障碍，因此需开发有效策略以增强放射免疫治疗疗效。过渡金属锰（Mn）作为新兴放射增敏剂，在桥接RT和免疫治疗方面具有潜力，其核心机制为激活cGAS-STING（cyclic GMP-AMP synthase–stimulator of interferon genes）先天免疫通路。cGAS可识别胞质中损伤DNA和抗原，促进环鸟苷酸-腺苷酸（cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate，cGAMP）合成，进而激活STING，产生I型干扰素（type I interferons，IFNs）和促炎细胞因子。Mn²⁺可加速cGAS整体催化活性并增强cGAMP与STING结合。但游离Mn²⁺在血液运输中存在急性脱靶毒性并快速清除，限制其临床应用。纳米制剂可通过肿瘤异常血管相关的增强渗透与滞留（enhanced permeability and retention，EPR）效应改善局部蓄积并减少脱靶。细胞膜包被纳米颗粒可延长循环时间、主动靶向并提高递送效率。肿瘤细胞膜还具有同源靶向等优势。基于此，研究人员提出简单合成锰基纳米平台（MnO₂–R848@CM），用于原位靶向放疗增敏联合免疫治疗。MnO₂可催化肿瘤来源H₂O₂分解产生氧气，缓解局部肿瘤缺氧并增强X射线诱导的细胞死亡。随后释放的Mn²⁺与R848（Toll样受体激动剂）及损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）共同增强cGAS-STING信号通路激活，产生I型IFNs，加速DCs成熟，并在RT后启动适应性免疫。该平台通过缓解肿瘤缺氧微环境、逆转免疫抑制TME、促进DCs成熟和增强CD8⁺ T细胞浸润，诱导强效抗肿瘤免疫。该论文发表在《Materials Today Bio》。

关键技术方法：研究人员制备MnO₂纳米片，以mPEG-NH₂修饰后与R848通过NH₂介导亲疏水作用、Mn–N配位和π–π堆积形成MnO₂-R848；自3T3和4T1细胞反复冻融提取细胞膜，与MnO₂-R848共挤出制备MnO₂-R848@CM。采用透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）、原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）、SDS-PAGE、粒径和zeta电位表征，并评估pH响应释放。以香豆素6（coumarin 6，C6）和DiR标记进行细胞摄取、流式及体内成像。通过MTT、γ-H2AX、DCFH-DA和凋亡流式评价放疗协同；检测钙网蛋白（calreticulin，CRT）、高迁移率族蛋白B1（high-mobility group box 1，HMGB1）和腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）。自小鼠骨髓分离未成熟CD11c⁺树突状细胞（iBMDCs），采用Transwell共培养、流式、ELISA和Western blot。建立4T1荷瘤Balb/c小鼠模型，动物实验经HKUST(GZ)-IACUC-2024-A0062批准。

研究结果：在“Construction and characterization of MnO₂-R848@CM nanoplatform”中，研究人员制备MnO₂-R848，随R848含量增加包封率（encapsulation efficiency，EE）逐渐升高，载药量（drug loading，DL）在MnO₂:R848为1:3时最大为35.70%。SDS-PAGE显示纯MnO₂-R848无蛋白条带，3T3 CM与4T1 CM蛋白丰度模式显著不同，而MnO₂-R848@CM与4T1 CM条带几乎一致，表明4T1 CM成功修饰于纳米片表面。粒径和厚度在载药及膜修饰后增加，膜修饰提高分散性、电负性和模拟体液中稳定性，尺寸持续低于200 nm。pH 5.0下R848释放明显快于pH 7.4，呈酸触发释放，表明其可作为肿瘤特异智能递送系统。在“MnO₂–R848@CM exhibits specific targeting towards breast cancer”中，C6标记实验显示MnO₂-C6@CM可被4T1细胞快速内化，1 h内绿色荧光迅速增强，约6 h达平台；4T1细胞荧光强度显著高于3T3细胞，流式结果一致，说明癌细胞膜仿生涂层增强内化和同源靶向递送。体内DiR成像显示，MnO₂-R848@CM在肿瘤部位信号显著高于游离DiR，12 h达峰，12 h荧光强度为游离DiR组的73.27倍。3T3膜包被对照无肿瘤富集，证明肿瘤蓄积和滞留由4T1癌细胞膜特异性介导，而非一般膜效应。在“In vitro synergistic antitumor effect of MnO₂–R848@CM and radiotherapy”中，3T3细胞在MnO₂浓度2.5 μg/mL时各处理组存活率超过80%，CM修饰组细胞活力更高，说明膜包被增强稳定性并降低细胞毒。4T1细胞在MnO₂浓度5 μg/mL时相对活力低于70%。6 Gy照射后，5 μg/mL MnO₂处理细胞活力约下降20%，表明MnO₂–R848@CM增强放疗疗效。γ-H2AX免疫荧光显示X射线诱导DNA损伤，MnO₂–R848@CM与RT共处理组荧光最强；ROS生成增加，凋亡增加，说明该平台通过放大ROS、加重DNA损伤、诱导周期阻滞和凋亡增强RT。在“In vitro synergistic antitumor effect of MnO₂–R848@CM and RT”中，研究人员检测ICD相关标志。CRT膜转位、HMGB1核释放和ATP释放结果显示，联合RT与纳米药物组CRT表面转位最高，HMGB1核表达最低，胞质HMGB1和ATP增加，表明联合处理增强ICD。BMDCs实验中，MnO₂或R848单独处理使成熟率（CD80⁺/CD86⁺）从59.2%升至76.2%和78.0%，MnO₂–R848效果更强；MnO₂-R848@CM与MnO₂-R848差异不显著但优于LPS阳性对照。TNF-α分泌显著增加。Transwell模型中，X射线使BMDC成熟从36.3%升至43%，MnO₂进一步升至77.5%，联合RT与MnO₂-R848@CM组TNF-α分泌最高。Western blot显示MnO₂可激活DCs中cGAS-STING通路，R848未额外增加p-STING，MnO₂-R848@CM激活最有效，说明膜修饰有助于RT后DCs成熟。在“In vivo synergistic antitumor effect of MnO₂–R848@CM and RT”中，4T1荷瘤Balb/c小鼠模型显示，MnO₂–R848@CM体内生物安全性良好，主要器官无病理变化或炎症浸润，ALT、AST、ALP、CREA和BUN与正常小鼠无显著差异。治疗分组包括盐水、R848、X射线、MnO₂–R848、MnO₂–R848加X射线、MnO₂–R848@CM及MnO₂–R848@CM加X射线。体重无显著变化。盐水组肿瘤快速生长；R848组呈降低趋势，联合RT增强；MnO₂-R848未联合RT效果不显著，RT后强氧化应激使4T1细胞对ROS诱导死亡更敏感。MnO₂–R848@CM增强肿瘤靶向蓄积和滞留，显著抑制肿瘤生长，抑瘤率达92.30%。H&E染色显示治疗肿瘤细胞排列不规则和坏死，MnO₂-R848@CM组凋亡细胞最多、细胞增殖抑制最强。CD8⁺ T细胞浸润较盐水组增加，联合组最显著；HIF-1α（hypoxia-inducible factor-1α）表达在联合组较盐水及单独RT组明显降低，表明有效缓解肿瘤缺氧。总体而言，MnO₂-R848@CM与RT联合在体外和体内4T1模型中均实现优良抑瘤效果，部分小鼠肿瘤完全消融。

讨论部分总结：研究人员指出，最终联合中存在一定“协同溢出”，即联合效果未较单组分提供显著额外获益，同时增加制备复杂性，未来将优化系统设计以支持进一步临床前抗肿瘤评价。既往报道提示肿瘤细胞膜自身可能作为佐剂启动下游免疫应答，因冻融或超声处理后独特表面膜蛋白可暴露，但本研究未充分探索；未来将研究细胞膜包被的额外收益及MnO₂-R848@CM启动的下游免疫事件。免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）原发耐药仍是临床挑战。MnO₂-R848@CM平台可能通过缓解缺氧、诱导ICD、激活cGAS-STING通路和递送R848，促进DCs成熟和CD8⁺ T细胞浸润，将免疫“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤。虽然本研究未直接联合anti-PD-1/PD-L1治疗，未来将在合适肿瘤模型中评估其克服ICI耐药的潜力。

研究结论翻译：综上，本研究引入一种仿生MnO₂纳米片平台，包被癌细胞膜并负载免疫佐剂R848（MnO₂–R848@CM），用于原位乳腺癌放射免疫治疗。该纳米平台在体内外对乳腺癌细胞表现出高度同源靶向。证据支持MnO₂–R848@CM在RT后协同放大ROS产生，对肿瘤细胞造成更严重DNA损伤，并通过提高ICD水平促进DCs肿瘤抗原呈递。值得注意的是，肿瘤酸性环境中MnO₂–R848@CM释放的R848和Mn²⁺通过cGAS-STING信号通路进一步增强适应性免疫应答，介导荷瘤小鼠肿瘤消融。本研究所设计的MnO₂–R848@CM提供了一种规避肿瘤缺氧微环境和克服肿瘤部位免疫耐受的新策略。总体而言，这些发现表明MnO₂–R848@CM纳米平台可显著增强临床RT初始疗效，同时引发持续免疫效应，从而改善整体抗肿瘤效果，并为乳腺癌RT和免疫治疗联合提供有前景的方法。