热带适应公羊高与低冻融精液耐冻性表型的精子及精浆蛋白质组分子图谱

《Molecular Reproduction and Development》：Global Proteomic Analysis of Sperm and Seminal Plasma From Tropically-Adapted Rams With Contrasting Parameters of Frozen-Thawed Semen

本研究旨在表征高精液冻融性（high semen freezability, HF）与低精液冻融性（low semen freezability, LF）公羊精子（sperm）与精浆（seminal plasma, SP）的蛋白质组。研究人员从12只公羊以3天间隔采集11次射精样本，并冷冻保存（共132份精液样本）。用于蛋白质组分析时，每只公羊的精子与SP样本分别混合。第1池和第2池分别包含奇数编号和偶数编号采集日获得的射精样本。由此产生24个精子池和24个SP池。精子与SP蛋白通过质谱（mass spectrometry, MS）分析，并使用计算生物学平台计算HF（n = 5）和LF（n = 7）公羊中的差异丰度蛋白（differentially abundant proteins, DAPs；p < 0.05）。HF公羊总精子活力（total sperm motility, TM）从鲜精的91.87% ± 0.63%降至冻融精液的65.65% ± 2.58%；LF公羊则从89.47% ± 1.15%降至50.05% ± 2.33%。冷冻保存后总精子活力下降幅度在HF公羊（26.22% ± 2.39%）低于LF公羊（37.70% ± 2.23%；p = 0.006）。HF公羊精子前向活力（progressive motility, PM）下降较少（从87.20% ± 0.50%降至58.12% ± 2.82%），而LF公羊下降较多（从85.54% ± 1.41%降至44.00 ± 2.13；p = 0.006）。HF表型公羊的质膜（plasma membrane）完整性（39.00% ± 2.79% vs. 15.14% ± 0.92%）和顶体完整性（acrosome integrity）（37.54% ± 2.72% vs. 15.40% ± 1.92%；p < 0.001）优于LF公羊。HF与LF公羊鲜精中的精子活力相似。HF与LF公羊中分别鉴定出1599和1677个精子蛋白，其中分别有73和76个DAPs。SP中鉴定出1127个蛋白，HF与LF公羊中分别有25和45个DAPs。这是已发表关于公羊SP蛋白质组覆盖度最高的结果。HF公羊中丰度较高的精子蛋白为细胞外和免疫相关蛋白、抗蛋白酶、伴侣蛋白（chaperones）和结构调节因子，参与细胞骨架完整性、抗凋亡和蛋白质稳态（proteostasis）维持。LF公羊中丰度较高的精子蛋白主要为线粒体亚基、轴丝组分和生物能量酶，表明对氧化过程依赖更强。HF SP的主要组分参与精子保护、膜脂稳定、钙流（calcium fluxes）、附睾成熟和ATP（adenosine triphosphate）可用性。LF SP蛋白质组主要与细胞应激、炎症反应、氧化损伤和ATP产生相关。因此，精子与SP蛋白质组图谱的性质可能决定公羊精子耐冻性（cryoresilience）。

论文主体解读

研究背景：精液冷冻保存是种质冷冻库和商业畜群遗传选择的重要生物技术工具，但其效率受个体差异以及冻融造成的细胞损伤限制，尤其是质膜和顶体膜损伤，进而影响冻融精子的活力、存活力和受精能力。冷冻过程中，精子暴露于渗透压应激和氧化应激，涉及温度快速变化和冷冻保护剂接触，影响脂质流动性和蛋白构象。公羊精液冷冻可诱导线粒体功能障碍和氧化应激增加，导致活力下降、结构完整性受损、线粒体膜电位丢失和ATP减少，并激活凋亡标志。蛋白质组研究已提示精子与SP蛋白与精液冷冻耐受性相关，但热带适应公羊中高低冻融精液耐冻性表型与精子及SP蛋白质组的关系仍需系统解析。因此，该研究旨在评估热带适应公羊精液冻融性与精子及SP蛋白质组的关联。

关键技术方法（不超过250字）：样本队列来自巴西Ceará联邦大学绵羊山羊单元，12只健康且生殖健全的hairy rams，2–6岁，平均体重50.8 ± 2.3 kg。以3天间隔采集11次精液，共132份，冷冻保存；按冻融后总精子活力下降幅度分为HF（n = 5）与LF（n = 7）。每只公羊分别将奇数和偶数采集日射精样本混合为精子与SP池，共24个精子池和24个SP池。精子与SP经蛋白提取或沉淀、胰酶消化和脱盐后，精子采用非标记液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）Orbitrap Q Exactive Plus分析，SP采用SYNAPT XS HDMA分析；分别用PatternLab和Progenesis QI鉴定与定量，检索UniProt Ovis aries UP000002356数据库，错误发现率（FDR）<1%；DAPs经统计筛选，主成分分析（PCA）用MetaboAnalyst，功能富集用Metascape。

研究结果：
3.1 HF与LF公羊的表征：通过鲜精及冻融后精子动力学、活力、形态、DNA完整性、质膜与顶体完整性、线粒体膜电位等评估。HF公羊冻融后TM降幅低于LF，PM降幅较低，质膜完整性和顶体完整性较高；而鲜精TM和PM在两组间相似。冻融后精子活力、正常形态、主要和次要缺陷、染色质完整性以及线粒体膜电位在HF与LF公羊间无显著差异。
3.1.1 HF与LF公羊精子及SP全局蛋白质组谱：通过质谱鉴定和PCA分析。精子中共鉴定1853个蛋白，HF和LF分别为1599和1677个，共享1423个；SP中共鉴定1127个蛋白，HF与LF全部共享。PCA显示精子蛋白丰度在两组间部分重叠，PC1解释14.7%方差，PC2解释8.6%；SP蛋白丰度呈部分但一致区分趋势，PC1解释26.4%方差，PC2解释20.1%。
3.1.2 HF与LF公羊精子DAPs的鉴定与功能分析：通过非标记质谱定量和功能富集。精子中149个DAPs，HF高丰度73个，LF高丰度76个。HF中高倍数蛋白包括5 kDa bactenecin、cathelicidin-2、N(4)-(beta-N-acetylglucosaminyl)-L-asparaginase、transcobalamin-2、cathelicidin-1等；LF中高倍数蛋白包括cilia- and flagella-associated protein 69、DCC-interacting protein 13-alpha、dynein regulatory complex protein 9、cytochrome b5 domain-containing protein 1、cytochrome b-c1 complex subunit 1, mitochondrial等。HF精子蛋白富集蛋白折叠、翻译后蛋白磷酸化、细胞周期过程正调控、肌动蛋白丝组织等；LF精子蛋白富集纤毛运动、糖酵解、丙酮酸代谢、精细胞发育、脂肪酸β氧化和受精等。MCODE分析显示LF精子蛋白互连于糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢和有氧呼吸，轴丝动力蛋白复合体组装、马达蛋白和纤毛运动，以及精子鞭毛运动、精子运动和运动细胞纤毛运动。
3.1.3 HF与LF公羊SP DAPs的鉴定与功能分析：通过SP蛋白质组定量和功能富集。HF SP中25个蛋白高丰度，LF SP中45个蛋白高丰度。HF SP高丰度蛋白包括beta-defensin、S100蛋白、epididymal sperm-binding protein 1（ESBP1）、T-complex protein 1 subunit zeta、14-3-3 domain-containing protein、proteasome subunit alpha type、aminopeptidase等；LF SP高丰度蛋白包括heat shock 70 kDa protein 13、haptoglobin、cytochrome c oxidase subunit 4、NADH dehydrogenase subunit 12等。HF SP富集MHC class I介导抗原加工和M期；LF SP富集蛋白折叠、细胞应激反应和小分子生物合成过程。

讨论总结：讨论指出，冻融后TM可作为精液冻融性的主要表型标志，鲜精参数难以预测冷冻耐受性，个体差异与精子和SP的内在分子特征有关。蛋白质组显示两组存在保守核心，差异主要在蛋白丰度而非有无。HF精子富集cathelicidins、HYOU1/HSP90B1、gelsolin、annexin、dystroglycan 1、ADAM28等，有利于膜与细胞骨架稳定、抗氧化、抗凋亡和蛋白质稳态。LF精子富集线粒体、鞭毛和代谢相关蛋白，提示对氧化代谢依赖更强，冷冻时更易发生线粒体、轴丝和代谢紊乱。HF SP中beta-defensin、WAP四二硫核心蛋白、T-complex protein 1 subunit zeta、14-3-3、PSMA3、S100、ESBP1、enolase等支持抗菌保护、膜稳定、Ca²⁺调节、附睾成熟和ATP供应；LF SP中HSPA13、PSMD8、haptoglobin及线粒体亚基等提示应激、炎症、氧化损伤和能量失衡。功能富集亦显示HF SP偏向MHC I抗原加工和M期，LF SP偏向应激、蛋白折叠和小分子合成。总体而言，该研究提示精子与SP蛋白质组景观可定义公羊精子耐冻性，为耐冻性生物标志物和精液冷冻保存及种畜选择改进提供分子框架。

研究结论翻译：本研究表明，HF与LF公羊在鲜精来源的精子与SP中具有不同的蛋白质组谱。HF公羊精子蛋白质组富集细胞外和免疫相关蛋白、抗蛋白酶、伴侣蛋白和结构调节因子，支持细胞骨架完整性、抗凋亡和蛋白质稳态。相反，线粒体亚基、轴丝组分和生物能量酶在LF公羊精子蛋白质组中占优势，表明对氧化代谢依赖更强。HF公羊SP含有主要与膜稳定、钙调节、附睾成熟和ATP可用性相关的蛋白，而LF公羊精液以与细胞应激、炎症反应和氧化损伤相关的蛋白为特征。这些发现建立了热带适应公羊冻融精液参数个体变异的分子框架，为鉴定精液耐冻性潜在生物标志物和改进精液冷冻保存与种畜选择方法提供基础。