KSHV vIRF3–PKM2相互作用诱导SMAD5乙酰化促进卡波西肉瘤进展

《Experimental & Molecular Medicine》：KSHV vIRF3–PKM2 interaction induces SMAD5 acetylation, promoting Kaposi’s sarcoma progression

　　

摘要专业翻译 卡波西肉瘤（Kaposi’s sarcoma, KS）是由卡波西肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus, KSHV）诱导的一种多中心性淋巴内皮来源肿瘤。然而，KS进展的潜在分子机制仍知之甚少。本研究发现KSHV vIRF3与丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2, PKM2）之间的相互作用调控淋巴内皮细胞（lymphatic endothelial cells, LECs）的代谢转换，在KSHV感染的LECs异种移植模型中诱导播散性内脏KS。在机制层面，vIRF3–PKM2相互作用通过增强PKM2酶活性提高细胞内乙酰辅酶A（acetyl coenzyme A, acetyl-CoA）水平，进而导致SMAD5乙酰化，促进LECs发生内皮-间质转化（endothelia-to-mesenchymal transition, EndMT）。值得注意的是，一种源自vIRF3的短肽可作为强效且选择性的PKM2拮抗剂，有效消退KS进展。综上所述，这些结果表明vIRF3通过将乙酰-CoA代谢重编程与癌症进展联系起来，在KS恶性转化中发挥关键作用。

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一、研究背景与科学问题

代谢重编程是肿瘤发生与进展的核心特征之一。尽管肿瘤在有氧条件下高度依赖糖酵解，但多数肿瘤仍保留线粒体呼吸以支持三羧酸（tricarboxylic acid, TCA）循环和合成代谢途径。乙酰辅酶A（acetyl coenzyme A, acetyl-CoA）作为连接糖酵解与TCA循环的关键代谢分子，既参与丙酮酸向乙酰-CoA的转化，也为蛋白质乙酰化提供乙酰基团，同时还是脂质合成等重要生物合成途径的关键前体。乙酰-CoA水平的失调与肿瘤发生的多个关键特征相关，并可能为治疗干预提供新靶点。

卡波西肉瘤（Kaposi’s sarcoma, KS）是由卡波西肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus, KSHV）引起的多灶性血管新生性肿瘤，起源于淋巴内皮细胞（lymphatic endothelial cells, LECs）。KS在临床上分为四个阶段，从惰性斑块和结节性病变（I期）进展为播散性皮肤黏膜及内脏受累（IV期），后者反映侵袭性肿瘤生物学行为。丙酮酸激酶（pyruvate kinase, PK）是糖酵解的限速酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的转化，从而与ATP产生及后续乙酰-CoA形成相连接。其中PKM2异构体在增殖细胞和癌细胞中优势表达，以四聚体形式支持糖酵解活性或以核内二聚体形式调控基因表达，在癌症代谢和进展中发挥关键作用。尽管已有研究表明KSHV通过HIF1α信号在血液内皮细胞（blood endothelial cells, BECs）中上调PKM2以促进糖酵解和血管生成，但PKM2在LECs（KS的公认起源细胞）中对KS发病机制的相关性仍不清楚。此外，KSHV复制和发病不同阶段所需的代谢多样性也日益受到关注，例如谷氨酰胺介导的回补反应支持TCA循环，而病毒蛋白vFLIP通过NF-κB信号抑制有氧糖酵解。值得注意的是，大多数KSHV诱导代谢研究均在低氧、体外条件下进行，且多使用BECs而非反映KS的LECs起源和体内背景的模型。因此，PKM2–乙酰-CoA轴在KSHV诱导的代谢可塑性和KS进展中的作用存在关键知识空白，亟需系统研究。

二、研究内容与主要结论

本研究系统阐明了KSHV通过调控LECs中的PKM2来维持高水平的细胞内乙酰-CoA，从而驱动KS进展的分子机制。研究人员发现KSHV病毒干扰素调节因子3（viral interferon regulatory factor 3, vIRF3）与PKM2的相互作用通过促进PKM2四聚化显著增强PK酶活性，导致细胞内乙酰-CoA水平升高。这种升高的乙酰-CoA主要归因于增强的丙酮酸分解代谢而非脂肪酸β-氧化（fatty acid β-oxidation, FAO）途径或谷氨酰胺分解。进一步的人源总蛋白乙酰化芯片分析揭示，升高的乙酰-CoA水平促进SMAD5乙酰化，从而诱导KSHV感染的LECs发生内皮-间质转化（endothelia-to-mesenchymal transition, EndMT）。在异种移植模型中，重组KSHV感染的LECs引起继发性肿瘤形成，而PKM2结合缺陷型突变KSHV则不能。重要的是，研究人员发现一种名为VDP的病毒短肽，通过竞争性结合PKM2拮抗vIRF3–PKM2相互作用，作为强效且选择性的PKM2拮抗剂，显著促进肿瘤消退。该研究发表在《Experimental & Molecular Medicine》期刊。

三、主要关键技术方法

本研究采用多种关键技术手段：免疫沉淀联合质谱分析（immunoprecipitation–mass spectrometry, IP–MS）鉴定vIRF3结合蛋白；细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC）介导的同源重组技术构建重组KSHV克隆（vIRF3突变体及回复突变体）；基于[U-¹³C]葡萄糖的稳定同位素示踪结合液相色谱-质谱（liquid chromatography–mass spectrometry, LC–MS）代谢组学分析；Seahorse XFp分析仪检测细胞外酸化率（extracellular acidification rate, ECAR）和耗氧率（oxygen consumption rate, OCR）；人源蛋白乙酰化芯片（Human Protein Acetylation Array G8000）进行全蛋白乙酰化谱分析；AlphaFold2-multimer蛋白复合物结构预测结合分子动力学模拟；生物层干涉法（biolayer interferometry, BLI）测定肽-蛋白结合动力学；以及小鼠异种移植模型（7周龄雌性无胸腺NCr-nu/nu小鼠，每组5只）和鸡胚绒毛尿囊膜（chorioallantoic membrane, CAM）侵袭模型用于体内功能验证。

四、研究结果

KSHV vIRF3与LECs中的PKM2相互作用

通过质谱分析鉴定出约60 kDa的多肽对应丙酮酸激酶M（PKM），作为vIRF3的新候选结合伙伴。GST pull-down实验显示vIRF3虽能与PKM1和PKM2均相互作用，但LECs中仅表达PKM2。详细结合实验确定vIRF3_250-280区域特异性地负责与PKM2的相互作用。据此构建vIRF3突变体（Δ250-280，即vIRF3-MT），该突变体不再与PKM2结合，但仍保留与IRF7、HIF1α和HDAC5的相互作用，可作为研究vIRF3–PKM2相互作用的有效阴性对照。

KSHV vIRF3–PKM2相互作用促进PKM2四聚化，增强PK活性

vIRF3-WT在LECs中显著增强PKM2四聚化，而vIRF3-MT则不能。PK酶活性测定显示，vIRF3-WT而非vIRF3-MT增加了PK活性和乙酰-CoA水平，同时降低乳酸浓度。Seahorse分析显示vIRF3-WT增强OCR（基础呼吸、ATP产生、质子漏、最大呼吸和备用呼吸能力均显著升高），而ECAR值显著降低，表明vIRF3–PKM2相互作用通过促进PKM2四聚化增强其酶活性，从而改变线粒体代谢。

KSHV vIRF3–PKM2相互作用显著升高所有TCA循环代谢物的丰度

LC–MS代谢组学分析显示，vIRF3-WT表达的LECs中丙酮酸和乙酰-CoA水平显著升高，TCA循环中间体（柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸和苹果酸）均增加。[U-¹³C]葡萄糖示踪实验表明，升高的丙酮酸主要呈现M+3同位素体，其脱羧产生的M+1或M+2乙酰-CoA作为TCA循环氧化分支生物合成的底物，支持vIRF3–PKM2相互作用通过增强PKM2活性激活糖酵解介导的乙酰-CoA合成。此外，vIRF3-WT表达细胞中总肉碱水平显著积累，而CPT1A表达和FAO中间体（trans-2-enoyl-CoA和ketoacyl-CoA）显著降低，表明FAO对扩大的乙酰-CoA池贡献极小，乙酰-CoA主要来源于增强的丙酮酸分解代谢。

KSHV vIRF3–PKM2增强丙酮酸分解来源的细胞内乙酰-CoA产生，导致SMAD5乙酰化触发EndMT

ACLY抑制剂BMS-303141处理实验表明，vIRF3表达大幅增加LECs的总体乙酰化水平，且该增加主要来源于丙酮酸分解代谢来源的柠檬酸。人源蛋白乙酰化芯片鉴定出24个乙酰化显著上调的蛋白，其中SMAD5被选为进一步研究对象。免疫共沉淀实验证实vIRF3-WT表达显著增加SMAD5乙酰化。vIRF3-WT表达下调内皮标志物（LYVE-1和VE-cadherin），同时上调间充质标志物（vimentin、fibronectin、N-cadherin和α-SMA）。3D球体侵袭实验和Boyden小室迁移实验表明，vIRF3介导的侵袭和迁移完全依赖SMAD5。共免疫沉淀鉴定p300为vIRF3表达LECs中与SMAD5相关的主要赖氨酸乙酰转移酶（lysine acetyltransferase, KAT），p300抑制剂A-485显著降低SMAD5乙酰化。

KSHV生命周期不受vIRF3–PKM2介导的PK活性增加影响

通过无痕突变技术构建了BAC16-Flag-vIRF3-MT（Δ250-280）突变病毒及其回复突变病毒。vIRF3-MT突变KSHV产生的病毒量与WT KSHV相当，不影响病毒复制或基因表达。感染LEC-E6/E7后，三种病毒的感染性和病毒基因表达无差异。然而，rKSHV-vIRF3-MT感染的细胞中PK活性和乙酰-CoA水平显著降低，3D球体侵袭能力显著减弱。在原代LECs中，rKSHV-WT或rKSHV-REV感染显著增加PK活性和乙酰-CoA水平，而rKSHV-vIRF3-MT感染则不能。软琼脂集落形成实验显示，rKSHV-WT或rKSHV-REV感染的原代LECs形成大量清晰集落，而rKSHV-vIRF3-MT感染的细胞集落形成显著减少。这些结果表明，vIRF3–PKM2相互作用虽对KSHV生命周期非必需，但对vIRF3驱动的代谢重编程、EndMT和KSHV诱导的致瘤潜能至关重要。

vIRF3–PKM2介导的PKM2活性上调促进KSHV相关肿瘤进展

皮下异种移植实验显示，rKSHV-BAC16-Flag-WT和rKSHV-REV-vIRF3-MT均有效促进肿瘤起始和生长，而rKSHV-BAC16-Flag-vIRF3-MT则不能。肿瘤内同时存在潜伏（GFP阳性）和裂解（RFP阳性）程序，裂解基因高表达区域细胞密度较低，潜伏基因高表达区域细胞密度较高。GFP表达在胃、脾和肝等多个器官中检测到，表明KSHV感染的LECs播散至接种部位以外的继发部位，而vIRF3-MT组未观察到继发肿瘤形成。组织病理学检查显示继发病变具有KS样特征，包括血管外红细胞、含铁血黄素和梭形细胞。免疫组化分析显示梭形细胞和浸润性非典型细胞对KSHV潜伏期相关核抗原（LANA）和vIRF3呈阳性，同时表达CD31和PROX1，支持双重内皮谱系表型——KS的标志性特征。人源vimentin阳性细胞在继发肿瘤部位被鉴定，证实继发病变来源于植入的KSHV感染人内皮细胞。

vIRF3衍生肽导致KSHV相关肿瘤显著消退

结合实验确定vIRF3区域（aa250-260）足以与PKM2相互作用，据此开发了vIRF3衍生肽VDP，并与HIV1 TAT转导域融合实现胞内递送。VDP有效抑制vIRF3诱导的PK活性和PKM2四聚化，通过竞争性结合阻断vIRF3与PKM2的相互作用。AlphaFold2-multimer结构预测显示VDP与PKM2单体上的α19-A和β23-A相互作用，主要通过相邻亚基α螺旋和β折叠之间的疏水相互作用。BLI实验显示VDP对PKM2具有高结合亲和力（解离常数K_d=1.28 μM），而突变肽mVDP结合亲和力降低29倍，且无法抑制vIRF3介导的乙酰-CoA和ATP水平上调。CAM侵袭实验显示TAT-VDP有效抑制vIRF3介导的侵袭。在小鼠异种移植模型中，TAT-VDP治疗显著抑制肿瘤生长，且在TAT治疗30天后改用TAT-VDP可使已形成的肿瘤显著消退。

五、总结与讨论

本研究揭示了KSHV vIRF3通过直接结合PKM2并促进其四聚化来增强PK酶活性，从而驱动LECs中乙酰-CoA代谢重编程的分子机制。升高的乙酰-CoA通过p300介导的SMAD5乙酰化触发EndMT，赋予LECs间充质样侵袭和迁移能力，最终促进KS的进展和播散。该研究将病毒蛋白与代谢重编程、表观遗传调控和肿瘤进展联系起来，为理解KS发病机制提供了新的概念框架。更重要的是，vIRF3衍生肽VDP作为强效且选择性的PKM2拮抗剂，通过竞争性阻断vIRF3–PKM2相互作用有效抑制KS肿瘤进展并促进肿瘤消退，为KS的靶向治疗提供了极具前景的新型候选药物。该研究不仅填补了KSHV诱导代谢可塑性中PKM2–乙酰-CoA轴作用的知识空白，也为开发基于代谢干预的KS治疗策略奠定了坚实的理论基础。