B细胞固有Ssu72磷酸酶在过敏性哮喘中的关键调控作用

《Experimental & Molecular Medicine》：B cell-intrinsic Ssu72 phosphatase is a key regulator of allergic asthma

　　

专业摘要翻译： B细胞来源的免疫球蛋白E（IgE）在过敏性哮喘的发生发展中发挥关键作用。然而，在这一背景下B细胞功能的固有调控机制尚未被完全阐明。本研究探讨了Ssu72磷酸酶在尘螨（HDM）诱导的哮喘中于B细胞内的表达及其作用。经抗CD40和IL-4刺激的B细胞以及浸润HDM诱导哮喘小鼠肺部的B细胞中，Ssu72表达显著升高。值得注意的是，在HDM诱导的哮喘模型中，与野生型小鼠相比，B细胞特异性敲除Ssu72的小鼠表现出明显减轻的肺部炎症以及更低水平的血清IgG1和IgE。此外，B细胞中Ssu72的缺失导致IgG1?和IgE?类别转换B细胞数量减少，可溶性CD23（sCD23）产生降低，这与含去整合素和金属蛋白酶结构域蛋白10（ADAM10）和基质金属蛋白酶9（MMP9）表达下降相关。在机制层面，研究人员的发现提示Ssu72缺失可能通过AMPKα的过度磷酸化导致AMPK–mTORC1平衡失调。在过继转移实验中，经HDM致敏后，Ssu72缺陷型B细胞在促进B细胞缺陷宿主中HDM诱导哮喘的效应阶段方面不如野生型B细胞有效。此外，B细胞特异性敲除Ssu72导致HDM诱导哮喘期间CD4?T细胞产生IL-4和IL-13减少，以及淋巴结和肺部B细胞中MHC II类分子上调减弱。这些发现将B细胞Ssu72确定为过敏性哮喘中B细胞活化和功能的关键调控因子。

论文解读文章：

一、研究背景与科学问题

过敏性哮喘是一种以气道炎症、气道高反应性和黏液过度分泌为特征的慢性疾病，其发病核心在于B细胞产生的过敏原特异性免疫球蛋白E（IgE）。IgE仅由B细胞合成，是过敏反应的核心介质，当机体再次接触过敏原时，IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞结合并触发其脱颗粒，从而引发哮喘的病理表现。此外，辅助性T细胞2型（T_H2）分泌的IL-4、IL-5和IL-13等细胞因子可促进局部IgE产生、嗜酸性粒细胞浸润、气道高反应性和黏液分泌。

IgE的产生可在多个环节受到调控，包括向IgE的类别转换重组（CSR）、IgE?抗体分泌细胞的存活以及CD23介导的调控。CSR发生在生发中心（GC），需要滤泡辅助性T细胞（T_FH）的协助。膜结合型CD23（mCD23）负向调控IgE产生，而可溶性CD23（sCD23）则被认为增强IgE合成。尽管B细胞外在因素如IL-4对IgE产生的调控已被广泛研究，但控制IgE产生的B细胞固有分子机制仍了解较少。

代谢程序已成为调控B细胞功能的关键因素。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是细胞能量感受器，其激活促进脂肪酸氧化、自噬和线粒体生物发生，同时抑制蛋白质和脂质合成。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）是受AMPK负调控的关键靶点。AMPK–mTORC1信号在T细胞效应功能、记忆细胞生成和存活中发挥重要作用，近期研究也发现AMPK支持记忆B细胞的持久性。

Ssu72是一种以组织特异性方式表达的双特异性蛋白磷酸酶。近期研究表明，Ssu72是免疫细胞中受体信号响应性磷酸酶，调控免疫细胞的功能、成熟和发育。Ssu72可通过结合GM-CSF受体β链调控肺泡巨噬细胞中GM-CSF受体信号的精细调节，也可结合并调控T细胞受体信号中ZAP-70和PLCγ1的磷酸化。然而，Ssu72在B细胞中的功能尚未被深入研究。本研究旨在探讨B细胞固有Ssu72在过敏性哮喘中对B细胞活化和功能的作用。

二、研究内容与主要结论

研究人员通过构建B细胞特异性Ssu72敲除小鼠（CD19-Cre；Ssu72^f/f，Ssu72-BKO），结合尘螨（HDM）诱导的过敏性哮喘模型，系统研究了Ssu72在B细胞中的功能。研究发现，B细胞中Ssu72的缺失显著减轻了哮喘气道炎症，降低了血清IgG1和IgE水平，减少了类别转换B细胞数量，并削弱了T_H2免疫应答。机制上，Ssu72通过与AMPKα相互作用调节AMPK–mTORC1信号平衡，并通过调控ADAM10和MMP9影响CD23的脱落。该研究发表于《Experimental & Molecular Medicine》，揭示了B细胞Ssu72作为过敏性哮喘关键调控因子的新功能，为哮喘治疗提供了潜在新靶点。

三、主要技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：利用Ssu72^f/f小鼠与CD19-Cre小鼠杂交构建B细胞特异性Ssu72敲除小鼠；采用HDM滴鼻致敏和激发方案建立小鼠过敏性哮喘模型；通过流式细胞术分析各类免疫细胞亚群、类别转换B细胞、GC B细胞和T_FH细胞；运用免疫印迹检测信号通路蛋白磷酸化水平；通过免疫共沉淀（Co-IP）验证Ssu72与AMPKα的相互作用；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清和培养上清中抗体及细胞因子水平；利用免疫组织化学和免疫荧光染色评估肺部炎症细胞浸润；通过过继转移实验将WT或Ssu72缺陷B细胞转入B细胞缺陷的μMT小鼠以评估效应阶段作用；运用RT–qPCR检测基因表达。

四、研究结果

Ssu72在HDM诱导哮喘模型的B细胞中表达上调：经抗CD40、抗IgM联合抗CD40以及T_H2细胞因子IL-4刺激后，B细胞中Ssu72表达显著升高。在HDM诱导的哮喘小鼠脾脏B细胞中，Ssu72的蛋白和mRNA水平均显著高于对照组。肺部免疫荧光染色显示，哮喘小鼠肺组织中B220?B细胞增多且Ssu72表达增强。

B细胞Ssu72缺失减轻HDM诱导哮喘的气道炎症并降低IgE水平：Ssu72-BKO小鼠在HDM诱导后表现出较少的肺部炎症细胞和较低的炎症评分。支气管肺泡灌洗液（BALF）中总细胞数、嗜酸性粒细胞、T细胞和B细胞数量均显著减少。血清总IgE、HDM特异性IgE和IgG1水平显著降低，而IgM、IgG2b和IgG3水平无差异，提示Ssu72缺失优先影响IgG1和IgE抗体应答。

Ssu72缺失减少类别转换的IgG1?和IgE?B细胞：HDM诱导后，Ssu72-BKO小鼠纵隔淋巴结中IgG1?B细胞、GC B细胞和T_FH细胞的比例和数量均显著低于WT小鼠。体外实验中，Ssu72缺陷B细胞经LPS加IL-4刺激后，IgG1?和IgE?B细胞比例及分泌的IgG1和IgE水平均显著降低，同时伴随增殖能力下降、存活率降低和早期活化标志物表达减少。

B细胞固有Ssu72参与mCD23表达和sCD23生成的调控：HDM诱导后，Ssu72-BKO小鼠血清sCD23水平显著低于WT小鼠，而mLN B细胞上mCD23表达反而升高。Ssu72缺陷B细胞中ADAM10的pro形式和成熟形式蛋白水平均降低，MMP9 mRNA表达下降。体外刺激实验同样证实Ssu72缺陷B细胞sCD23产生减少、mCD23表达升高、ADAM10和MMP9水平降低。公共数据库分析显示活化人B细胞中Ssu72与MMP9表达呈正相关。

B细胞固有Ssu72与AMPKα相互作用：Ssu72-BKO B细胞中mTORC1下游靶标p-S6K和p-S6表达显著降低，而AMPKα在Thr172位点的磷酸化显著升高。Co-IP实验在293T细胞和Ramos细胞中均证实Ssu72与AMPKα存在物理相互作用。

B细胞Ssu72缺失减弱HDM诱导哮喘效应阶段的气道炎症：将Ssu72缺陷B细胞过继转移至致敏的μMT小鼠后，小鼠肺部炎症评分降低，BALF中总细胞、嗜酸性粒细胞、T细胞和B细胞数量减少，血清IgE水平显著低于接受WT B细胞的小鼠。

B细胞Ssu72缺失减轻HDM诱导哮喘中的T_H2免疫应答：Ssu72-BKO小鼠肺部和mLN中产生IL-4和IL-13的CD4?T细胞比例显著降低，BALF和血清中IL-4浓度下降。mLN和肺部B细胞上MHC II类分子表达在Ssu72-BKO小鼠中持续低于WT小鼠。

五、讨论与结论

本研究表明，B细胞固有Ssu72在过敏性哮喘中发挥关键调控作用。Ssu72在活化B细胞中表达上调，通过调控类别转换、CD23脱落和AMPK–mTORC1信号通路影响IgE和IgG1的产生。值得注意的是，Ssu72缺失并不损害系统性体液免疫应答，NP-KLH、NP-LPS和NP-Ficoll免疫后GC形成和抗体产生均正常，提示Ssu72在过敏性气道炎症的黏膜T_H2免疫环境中具有情境依赖性需求。

机制上，Ssu72可能作为磷酸酶直接使AMPKα去磷酸化，Ssu72缺失导致AMPKα过度磷酸化，进而过度抑制mTORC1活性，限制类别转换B细胞生存和抗体产生所需的合成代谢程序。同时，Ssu72通过调控ADAM10和MMP9影响mCD23向sCD23的脱落，sCD23减少可能直接导致IgE水平降低。

研究结论：B细胞Ssu72是过敏性哮喘中B细胞活化和功能的关键调控因子，特异性靶向B细胞中的Ssu72可能成为治疗过敏性哮喘的候选策略，且不会广泛损害系统性体液免疫。