木犀草素通过抑制ROS蓄积和恢复Bax/Bcl2平衡减轻阿西替尼诱导的小鼠亚临床心脏损伤与心肌细胞凋亡

《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》：Luteolin Alleviates Axitinib-Induced Cardiomyocyte Apoptosis in Mice

阿西替尼（Axitinib），一种酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor, TKI），在临床实践中与心脏毒性风险相关。然而，其潜在毒理学机制仍不清楚，且缺乏有效的心脏保护策略。本研究旨在探讨阿西替尼诱导心脏损伤的机制，并评估木犀草素的保护作用。在本研究中，C57BL/6小鼠随机分为四组：对照组、阿西替尼组、阿西替尼+木犀草素组和单用木犀草素组。通过超声心动图评估心室收缩功能（EF/FS/LVEDD/LVESD）。测量血清心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T, cTnT）水平以评估心脏毒性。通过苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, HE）和Masson三色染色观察组织病理学变化。使用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling, TUNEL）染色定量心肌凋亡，并通过蛋白免疫印迹（Western blot）分析凋亡相关蛋白（Bax/Bcl2）。使用二氢乙锭（dihydroethidium, DHE）染色评估活性氧（reactive oxygen species, ROS）蓄积。结果显示，与对照组相比，阿西替尼未显著改变超声心动图参数，但显著升高血清cTnT水平，表明亚临床心脏毒性。此外，阿西替尼诱导显著的组织病理学变化，促进异常ROS蓄积，上调Bax/Bcl2比值，并触发心肌细胞凋亡。木犀草素共给药显著降低ROS水平，恢复Bax/Bcl2平衡，并有效减轻阿西替尼诱导的心脏毒性和凋亡。总之，阿西替尼通过促进ROS生成和破坏Bax/Bcl2平衡，从而激活心肌细胞凋亡，诱导亚临床心脏损伤。木犀草素通过抑制ROS蓄积和纠正凋亡通路失调发挥显著心脏保护作用，为预防和治疗靶向治疗诱导的心脏毒性提供有前景的新策略。

研究背景方面，酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor, TKI）通过阻断信号转导抑制细胞增殖，已广泛用于肿瘤等疾病临床治疗。然而药物警戒数据和临床研究显示，TKI可诱导不同程度心脏毒性，且风险因药物靶点而异。其中血管内皮生长因子受体（Vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR）抑制剂如阿西替尼（axitinib）与心血管毒性相关，临床常表现为高血压、左心室射血分数（left ventricular ejection fraction, LVEF）下降和心力衰竭。临床报告显示，转移性肾细胞癌患者接受阿西替尼联合免疫治疗后6天出现LVEF下降和心尖壁运动异常，停药后心肌功能逐渐恢复。基础研究显示，多种TKI可经多途径导致心脏毒性，机制主要涉及线粒体功能障碍、氧化应激、自噬-溶酶体通路阻断和胞质Ca²⁺超载，进而导致心肌细胞骨架重塑和凋亡；MAPK和PI3K等信号通路失衡也与部分药物心脏毒性相关。但阿西替尼作为临床常用VEGFR-TKI，其诱导心脏损伤的具体分子机制仍不清楚，限制相关靶向干预策略开发。木犀草素作为天然黄酮类化合物，既往研究显示其具有多靶点心脏保护作用，可抑制SHP2信号减轻心肌肥厚和纤维化，激活线粒体BK通道改善心肌缺血/再灌注损伤，调节p53通路发挥抗凋亡和抗氧化作用，并可改善代谢紊乱模型中心脏功能障碍。基于此，研究人员旨在研究阿西替尼对C57BL/6小鼠心脏功能和结构的影响及潜在分子机制，并评估木犀草素对阿西替尼诱导心脏损伤的作用，为临床防治靶向药物相关心脏毒性提供实验证据。

研究人员开展的研究显示，C57BL/6小鼠随机分为对照组、阿西替尼组、阿西替尼+木犀草素组和单用木犀草素组，建模1周。结果显示，阿西替尼未显著改变超声心动图参数，但显著升高血清心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T, cTnT），诱导组织病理学变化、异常活性氧（reactive oxygen species, ROS）蓄积、Bax/Bcl2比值上调和心肌细胞凋亡；木犀草素共给药可显著降低ROS水平、恢复Bax/Bcl2平衡并减轻心脏毒性和凋亡。研究结论表明，阿西替尼通过促进ROS生成和破坏Bax/Bcl2平衡激活心肌细胞凋亡，诱导亚临床心脏损伤；木犀草素通过抑制ROS蓄积和纠正凋亡通路失调发挥心脏保护作用，为靶向治疗诱导心脏毒性的防治提供新策略。其重要意义在于提示阿西替尼心脏损伤存在早期窗口期，强调监测心脏毒性生物标志物，并支持木犀草素作为潜在候选化合物。

关键技术方法方面，研究使用6周龄雄性C57BL/6小鼠，购自GemPharmatech Co. Ltd.（中国），随机分为对照组、阿西替尼组、阿西替尼+木犀草素组和木犀草素单用组，建模1周；动物实验经North Sichuan Medical College Animal Ethics Committee批准（Approval No. 2024107）。采用超声心动图评估心室收缩功能；检测血清cTnT；苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, HE）与Masson三色染色观察心肌结构和胶原；末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling, TUNEL）染色定量凋亡；蛋白免疫印迹（Western blot）检测Bax、Bcl2和GAPDH；AC16人心肌细胞系用于体外实验，细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8, CCK-8）测细胞活力，二氢乙锭（dihydroethidium, DHE）染色检测细胞内ROS；统计采用GraphPad Prism 9，数据以mean ± SEM表示，多组比较用单因素方差分析（one-way ANOVA）。

研究结果如下。3.1 阿西替尼和木犀草素对C57BL/6小鼠心脏功能无显著影响：经胸超声心动图评估，各组LVEF、左心室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening, LVFS）、左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic dimension, LVEDD）和左心室收缩末期内径（left ventricular end-systolic dimension, LVESD）均无统计学差异，表明阿西替尼和木犀草素未显著影响小鼠心脏功能。3.2 木犀草素降低阿西替尼诱导的小鼠cTnT水平升高：检测血清cTnT，阿西替尼组显著高于对照组，阿西替尼+木犀草素组显著降低，单用木犀草素无显著影响；提示阿西替尼虽未损害收缩功能，但诱导心肌细胞损伤，木犀草素可减轻。3.3 木犀草素减轻阿西替尼诱导的小鼠心肌细胞病理损伤：HE染色显示对照组心肌纤维排列有序，阿西替尼组出现肌原纤维破坏、炎症细胞浸润和部分心肌细胞核固缩，联合组病变显著减轻；Masson染色显示阿西替尼组胶原沉积少但心肌纤维排列紊乱，联合组改善，单用木犀草素无影响；表明阿西替尼诱导显著病理损伤，木犀草素减轻。3.4 木犀草素减轻阿西替尼诱导的小鼠心肌细胞凋亡：TUNEL染色显示阿西替尼组阳性细胞显著增加，联合组显著减少，单用木犀草素无显著影响；与cTnT降低和组织学改善一致，且无显著纤维化、超声功能正常，提示心脏毒性处于可逆、凋亡主导阶段。3.5 木犀草素逆转阿西替尼诱导的小鼠心脏Bax/Bcl2比值升高：Western blot检测显示阿西替尼组Bax/Bcl2比值升高，提示线粒体凋亡通路激活；联合木犀草素有效逆转，单用木犀草素与对照无显著差异。3.6 木犀草素通过阻断Bax/Bcl2通路减轻AC16心肌细胞中阿西替尼诱导的凋亡，体外保护效果与卡托普利相当：AC16细胞中CCK-8测得阿西替尼半数抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration, IC₅₀）为10.47 μM；阿西替尼5 μM、24 h可显著升高Bax/Bcl2，木犀草素50 μM、24 h可下调该比值，与体内一致。引入卡托普利（captopril）10 μM、24 h作为阳性对照，卡托普利也显著逆转Bax/Bcl2升高，提示木犀草素体外保护效果与经典心血管药物相当。3.7 木犀草素通过抑制ROS蓄积改善阿西替尼诱导的凋亡：DHE染色显示阿西替尼显著诱导AC16细胞ROS大量蓄积，木犀草素共处理有效抑制，单用木犀草素无显著影响；引入Tempol（250 μM，24 h）作为广谱ROS清除剂，Western blot显示Tempol显著逆转阿西替尼诱导的Bax/Bcl2升高，单用无影响；提示阿西替尼诱导凋亡高度依赖胞内ROS过度产生，木犀草素通过抗氧化清除过量ROS，阻断下游Bax/Bcl2介导的线粒体凋亡信号。

讨论部分指出，研究揭示阿西替尼通过增加ROS水平，破坏Bax/Bcl2平衡，导致TUNEL阳性心肌细胞增加，并伴随cTnT升高和HE病理变化；木犀草素通过降低ROS、恢复Bax/Bcl2平衡和抑制凋亡减轻损伤，且这些改变均发生在亚临床阶段，超声功能正常且无明显纤维化。超声未显示收缩或舒张功能显著改变但cTnT升高，表明cTnT释放先于功能失代偿；cTnT作为高特异、敏感循环生物标志物，其升高提示心肌细胞膜完整性破坏或细胞死亡，包括凋亡。早期损伤可能被心脏代偿能力抵消，处于亚临床心脏损伤阶段，类似临床早期心肌损伤，常规方法难以检测；细胞和分子证据较超声更敏感。HE显示结构损伤，TUNEL证实凋亡，但胶原沉积不突出，可能尚未进展至纤维化阶段，提示早期干预窗口。与斑马鱼胚胎模型相比，阿西替尼50 μM仅20%胚胎出现心包水肿，提示相对温和；与其他VEGFR-TKI相比，阿西替尼治疗窗更宽，潜在安全性更好。木犀草素通过调节Bax/Bcl2减轻损伤，体外与卡托普利比较，二者均显著逆转Bax/Bcl2异常升高，保护效果相当。该抗凋亡机制与木犀草素在其他心脏模型中的作用一致，如缺血/再灌注损伤中降低Bax、增加Bcl2减少凋亡，代谢综合征大鼠中抑制凋亡、炎症和氧化应激并促进自噬，提示其为潜在天然保护化合物。研究也说明动物模型和剂量：阿西替尼50 mg/kg基于既往体内药理研究，可模拟临床显著抗肿瘤效应；1周短程给药主要受急性毒性耐受限制，预实验和已发表阿西替尼严重肾足细胞损伤研究显示1周连续给药后小鼠出现体重下降、嗜睡等全身恶化，延长给药死亡率高。临床相关性上，慢性心力衰竭更常见于长期靶向治疗，但早期高血压和急性心脏下降也重要；临床病例中部分患者接受阿西替尼治疗6天即出现LVEF下降和心尖壁运动异常。因此1周模型模拟早期/急性亚临床心脏损伤，特征为cTnT升高和凋亡而无EF/FS显著下降，强调早期监测生物标志物。木犀草素100 mg/kg基于既往药理文献，可在体内有效发挥抗氧化和多器官保护作用且无明显副作用。局限包括1周高剂量方案为急性毒性模型，可能不完全重现慢性进展性心脏毒性，全身恶化可能部分混杂心脏特异性读数；未来需长期低剂量阿西替尼并监测药代动力学以近似临床稳态暴露。体外5 μM高于患者稳态血浆水平，基于24 h细胞毒性试验IC₅₀ 10.47 μM选择半IC₅₀，以诱导明确凋亡和氧化应激并避免过度坏死掩盖保护作用；2D培养缺乏血流动力学、神经体液因素和体内继发心脏损伤，需较高浓度急性重现慢性累积损伤，AC16永生化细胞可能比原代人心肌细胞更耐受。木犀草素对夸张急性应激有强细胞保护，但未在临床可达到阿西替尼浓度直接测试，其转化潜力尚需验证。TKI心血管并发症常涉及复杂多通路网络，文献报道还可通过线粒体功能障碍、破坏胞内Ca²⁺稳态导致Ca²⁺超载、抑制保护性PI3K/AKT生存信号导致心肌损伤；ROS蓄积常与线粒体通透性转换孔异常开放和Ca²⁺处理异常交织，形成细胞应激恶性循环。阿西替尼可能通过脱靶效应抑制心肌细胞PI3K/AKT磷酸化。木犀草素为多靶点黄酮，其保护是否部分通过保护线粒体功能或恢复PI3K/AKT信号等替代通路尚待探索。结论部分翻译：总之，本研究表明阿西替尼在给药早期诱导亚临床心脏损伤。机制与异常ROS蓄积引起的Bax/Bcl2比值失衡和心肌细胞凋亡密切相关。该发现提示阿西替尼诱导心脏损伤存在窗口期，即病理变化发生而心脏功能无明显异常。因此，临床靶向治疗早期密切监测心脏毒性生物标志物对预防后期严重心脏下降重要。同时，本研究证实天然化合物木犀草素有效逆转Bax/Bcl2失衡，显示与经典心血管药物相当的心脏保护效果。这些结果为理解靶向药物心脏毒性机制提供实验证据，并提示木犀草素是防治此类药物不良反应的潜在候选化合物。