上皮衰老相关SASP经TGF-β1/SMAD2轴促进前列腺癌成纤维细胞重编程与细胞外基质重塑

《Neoplasia》：Senescence-associated prostate cancer cells promote fibroblast reprogramming and extracellular matrix remodeling

　　

背景：细胞衰老通过衰老相关分泌表型（SASP）影响肿瘤进展，但前列腺上皮细胞中衰老相关改变是否促进基质重塑仍知之甚少。方法：整合人前列腺癌标本、公共单细胞RNA测序数据集、前列腺特异性Pten条件性敲除（Pten-cKO）小鼠模型、小鼠单细胞转录组分析及机制性体外实验，以研究衰老与基质重塑。采用组织病理学分析、多重免疫荧光染色、转录组谱分析、条件培养基实验、衰老细胞清除干预及药理学抑制实验，表征上皮-成纤维细胞相互作用及其潜在机制。结果：衰老相关表型随PCa分级增加而逐步富集，并主要定位于上皮区室。人单细胞转录组分析显示，上皮衰老/SASP程序与成纤维细胞ECM重塑程序同时激活，且与上皮-基质通讯相关的促纤维化分泌特征富集。一致地，Pten-cKO小鼠前列腺表现出上皮衰老相关表型增加、胶原沉积和成纤维细胞ECM重塑活性增强。机制上，DOX诱导衰老的RM1前列腺癌细胞获得以TGF-β₁分泌增强为特征的促纤维化分泌表型。ABT-263衰老细胞清除处理减少了衰老相关细胞群体和TGF-β₁分泌，而ABT-263处理后收集的条件培养基表现出减弱的成纤维细胞重塑活性。DOX-RM1条件培养基将NIH/3T3成纤维细胞重编程为ECM重塑型CAF样状态，表现为胶原沉积增强以及基质相关基因和蛋白表达上调。药理学抑制TGF-β信号减弱SMAD2磷酸化，并部分逆转成纤维细胞活化和ECM重塑。结论：这些发现确定上皮衰老相关信号是将前列腺上皮改变与成纤维细胞重编程和ECM重塑联系起来的机制。促纤维化肿瘤细胞分泌程序促进成纤维细胞获得ECM重塑型CAF样表型，至少部分通过TGF-β/SMAD2信号，并促进前列腺肿瘤微环境的纤维化重塑。

Chongsen Lin、Qianyu Guo、Shaohong Lai的研究聚焦前列腺癌（prostate cancer, PCa）中上皮衰老相关状态与基质重塑。研究背景是，PCa是男性常见恶性肿瘤和癌症死亡原因之一，进展至去势抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer, CRPC）仍是临床障碍；雄激素剥夺治疗（androgen deprivation therapy, ADT）是晚期PCa治疗基石，但治疗抵抗常出现。肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中，癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）通过细胞外基质（extracellular matrix, ECM）沉积与重塑、生长因子分泌及肿瘤-基质通讯促进进展；TGF-β是成纤维细胞活化和ECM重塑的重要调节因子，下游SMAD信号包括SMAD2激活参与基质产生和成纤维细胞重编程。细胞衰老是应激相关状态，早期可抑瘤，但持续衰老细胞通过SASP调节邻近细胞，SASP可包含促纤维化介质。PTEN缺失可诱导衰老相关程序，但衰老细胞可能在肿瘤演化中持续存在。已有研究多关注衰老基质成纤维细胞，尚不清楚PCa上皮细胞来源的衰老相关改变是否主动调节邻近成纤维细胞，以及靶向衰老相关肿瘤细胞能否减弱基质重塑。研究人员整合人PCa标本、人和小鼠单细胞RNA测序、前列腺上皮特异性Pten条件性敲除小鼠、衰老细胞清除干预和机制性体外实验，得出上皮衰老相关信号连接前列腺上皮改变与成纤维细胞重编程和ECM重塑，促纤维化肿瘤细胞分泌程序至少部分通过TGF-β/SMAD2信号促进成纤维细胞获得ECM重塑型CAF样表型，并参与前列腺肿瘤微环境纤维化重塑。该研究意义在于将肿瘤细胞衰老的生物学后果从增殖停滞扩展到肿瘤-基质通讯和ECM重塑，并提示靶向衰老相关肿瘤-基质相互作用可能具有治疗潜力。

关键技术方法概括（不超过250字）：研究人员使用人前列腺组织队列，来源为中山大学附属第七医院接受前列腺活检或根治性前列腺切除术患者，分为组织学正常、Gleason 6-7、Gleason 8-10三组，每组10例，并排除术前接受新辅助化疗、放疗或ADT者；使用公共人scRNA-seq数据GSE117403和OMIX008930。构建前列腺上皮特异性Pten-cKO小鼠，采用Tmprss2-Cre^ERT2与Pten^fl/fl杂交，6周他莫昔芬诱导，20周取材；并对对照和Pten-cKO小鼠前列腺进行scRNA-seq。体外使用RM1、Myc-CaP和NIH/3T3细胞，采用DOX诱导衰老、ABT-263衰老细胞清除、条件培养基刺激和SB431542抑制TGF-β信号，结合组织学、多重免疫荧光、转录组、ELISA和Western blot分析。

研究结果一：衰老相关上皮表型在人PCa中随分级逐步富集。通过人前列腺组织队列的SA-β-gal染色、Ki67、p16和p21免疫组化及CK8/α-SMA多重免疫荧光，研究人员发现SA-β-gal阳性面积随肿瘤分级升高而增加，Ki67阳性细胞比例也增加，提示增殖和衰老相关细胞群体在异质性PCa组织中共存；p16和p21阳性细胞分数在PCa中增加，且p16、p21优先定位于CK8阳性上皮区域而非α-SMA阳性基质区。

研究结果二：单细胞转录组分析揭示人PCa中上皮衰老相关程序与CAF ECM重塑程序并发。通过分析正常前列腺和原发PCa的scRNA-seq数据，研究人员鉴定主要细胞群和成纤维细胞亚群；PCa上皮细胞显示多种衰老相关基因表达增加、SASP和衰老评分升高；CellChat预测上皮-成纤维细胞通讯涉及PDGF、laminin、MIF和TGF-β相关配受体；相关分析显示ECM/myCAF模块、SASP相关炎症和免疫调节基因及桥接调节因子存在协同关系；PCa上皮细胞促纤维化SASP相关因子表达较高，PCa成纤维细胞ECM重塑评分较高。

研究结果三：前列腺上皮Pten缺失与体内衰老相关上皮表型和促纤维化微环境相关。通过Pten-cKO小鼠，研究人员发现前列腺增大、前列腺重量增加，SA-β-gal阳性面积显著增加，组织病理学改变明显，p16和p21阳性细胞分数增加，p21主要位于CK8阳性上皮区域而非α-SMA阳性基质区域；Masson染色显示胶原沉积增加，RT-qPCR显示Tgfb1、Thbs1、Il1b、Ccl2、Cxcl9、Il6和Cxcl1等炎症及促纤维化因子表达上调。

研究结果四：单细胞转录组分析揭示Pten缺失后上皮衰老相关程序和成纤维细胞ECM重塑程序并发。通过对3只对照和3只Pten-cKO小鼠前列腺进行scRNA-seq，质量控制后保留75,660个细胞，其中对照33,826个、Pten-cKO 41,834个；Pten-cKO上皮细胞衰老评分高于对照；成纤维细胞亚群包括ECM重塑CAF、收缩性CAF、炎症性CAF、血管周样成纤维细胞和其他成纤维细胞；Pten-cKO中ECM重塑CAF比例增加但样本水平未达统计学显著；Pten-cKO成纤维细胞ECM重塑评分较高，Col1a1、Col1a2、Col3a1、Fn1、Postn和Sparc等基质相关基因上调；GSEA显示ECM组织、TGF-β反应、细胞-基质黏附、ECM-受体相互作用和胶原组织等通路正富集；细胞通讯分析预测上皮细胞与多个成纤维细胞亚群存在相互作用。

研究结果五：衰老相关PCa细胞获得以TGF-β₁分泌增强为特征的促纤维化分泌表型。通过100 nM DOX处理RM1细胞72 h诱导衰老，研究人员发现DOX-RM1细胞形态改变、EdU掺入减少、SA-β-gal活性增加；转录组显示衰老、应激、炎症和分泌程序增加，细胞周期相关基因受抑制；GO富集分析与细胞通讯、ECM和黏附重塑、细胞因子和炎症反应相关。ELISA显示DOX-RM1条件培养基中TGF-β₁分泌显著增加，PDGF-BB无显著改变；80 nM DOX处理的Myc-CaP细胞也表现衰老相关表型，支持可重复性。

研究结果六：衰老相关肿瘤细胞分泌组促进成纤维细胞ECM重塑。研究人员用RM1-CM或DOX-RM1-CM处理NIH/3T3成纤维细胞48 h，发现DOX-RM1-CM诱导形态改变、胶原沉积增加，α-SMA和COL1A1表达增加；转录组显示ECM重塑/基质组织和非经典免疫调节程序诱导，而常规SASP相关程序未显著改变；RT-qPCR和Western blot证实α-SMA、COL1A1、POSTN和COL3A1表达升高；DOX处理的Myc-CaP条件培养基也产生类似形态和转录改变；成纤维细胞未明显转向任一单一经典CAF亚型，而被解释为ECM重塑CAF样状态。

研究结果七：衰老细胞清除治疗和TGF-β/SMAD2抑制减弱成纤维细胞ECM重塑。通过ABT-263处理DOX-RM1细胞，研究人员发现SA-β-gal阳性细胞群体降低，条件培养基中TGF-β₁水平降低；ABT-263处理后条件培养基在NIH/3T3中诱导的胶原沉积、α-SMA和COL1A1表达均低于DOX-RM1-CM；DOX处理的Myc-CaP细胞中ABT-263也降低SA-β-gal阳性和TGF-β₁分泌。使用SB431542抑制TGF-β受体信号后，DOX-RM1-CM诱导的胶原沉积、α-SMA和COL1A1表达显著减弱；DOX-RM1-CM增加p-SMAD2/SMAD2比值，SB431542降低该比值，并降低COL1A1和α-SMA蛋白水平；但抑制效果为部分性，提示其他肿瘤来源因子可能协同TGF-β信号。

讨论部分总结：细胞衰老具有背景依赖性，既有抑瘤也有促瘤作用；持续衰老细胞可通过旁分泌和SASP调节周围组织。该研究提出上皮衰老相关状态参与PCa基质重塑，ABT-263减少衰老相关特征和TGF-β₁分泌并减弱肿瘤细胞分泌组的成纤维细胞重塑活性。高分级肿瘤中Ki67阳性细胞和衰老标志同时增加，可能反映瘤内异质性，即增殖和衰老相关群体共存，而非同一细胞同时具有两种状态。PTEN缺失可诱导细胞衰老作为内在屏障，但该衰老状态重编程后可改变生物学后果；SASP高度异质，可包含不同于经典促炎SASP的TGF-β丰富程序。CAF具有异质性和可塑性，本研究中的成纤维细胞未整体转向单一经典CAF亚型，而是主要表现为ECM组织和基质重塑程序，因此被定义为ECM重塑CAF样状态。ECM重塑可改变组织结构和硬度、机械转导、生长因子生物利用度及肿瘤-基质串扰，但本研究未直接检测这些下游后果。上皮衰老不可能是唯一决定因素，肿瘤基因型、治疗史、免疫背景和其他基质成分也影响成纤维细胞状态。机制上，TGF-β/SMAD2信号是重要组成部分，但不是唯一介质。治疗上，靶向衰老相关肿瘤-基质相互作用，如ABT-263衰老细胞清除和抑制TGF-β信号，可能成为潜在策略。局限包括：ABT-263药理清除不能完全替代细胞类型特异性遗传清除；分泌介质全谱未完全明确；体外研究依赖小鼠PCa细胞和NIH/3T3成纤维细胞；DOX是实验性衰老诱导剂而非临床PCa治疗模型，其衰老分泌程序可能不能完全模拟肿瘤进展或ADT相关衰老；衰老诱导ECM重塑对肿瘤进展、免疫调节和治疗抵抗的影响尚待阐明。

研究结论翻译：这些发现确定衰老相关肿瘤-基质通讯是将前列腺上皮应激与基质ECM重塑联系起来的机制。衰老相关上皮状态在PCa分级升高和Pten缺陷前列腺中富集，并伴随成纤维细胞ECM重塑程序激活。机制上，衰老相关PCa细胞获得促纤维化分泌表型，促进成纤维细胞重编程为ECM重塑型CAF样状态，而衰老细胞清除治疗减弱这种基质反应。TGF-β/SMAD2信号参与这种肿瘤-成纤维细胞通讯，但不是唯一介质。总体而言，这些发现将肿瘤细胞衰老的生物学后果扩展到增殖停滞之外，并支持一个衰老相关肿瘤-基质信号轴参与前列腺肿瘤微环境重塑。