血浆PINK1/Parkin比值与ATF5作为帕金森病异动症潜在生物标志物的研究

《Neurobiology of Disease》：Plasma PINK1/Parkin ratio and ATF5 as potential biomarkers associated with dyskinesia in Parkinson's disease

　　

线粒体自噬和UPRmt生物标志物不能区分伴有运动并发症（MC）与不伴有运动并发症（NMC）的帕金森病（PD）患者。血浆PINK1/Parkin比值与PD患者 prevalent 异动症（DYS）相关。经批次校正后，ATF5与PD患者异动症相关。一个三生物标志物组合显示出对异动症的探索性判别价值。循环线粒体质量控制系统（MQC）标志物与PD患者 prevalent 异动症相关。

论文解读

一、研究背景与研究目的

帕金森病（Parkinson's disease, PD）是全球第二常见的年龄相关神经退行性疾病，约影响60岁以上人群中1%的个体，且患病率随人口老龄化持续上升。该病的神经病理学特征为黑质致密部（substantia nigra pars compacta, SNpc）多巴胺能神经元的进行性退变，导致纹状体多巴胺耗竭，进而出现运动迟缓、肌强直、震颤和姿势不稳等经典运动症状。左旋多巴已成为缓解运动症状的基石性对症治疗药物，但其长期使用常并发运动并发症（motor complications, MCs），5至10年内影响高达80%的患者，显著降低生活质量。运动并发症表现为两种不同亚型：剂末现象（wearing-off, WO），反映因黑质纹状体通路持续退变导致的左旋多巴反应持续时间进行性缩短；以及异动症（dyskinesia, DYS），反映适应不良的可塑性和间歇性多巴胺能刺激所导致的不自主运动。迄今为止，针对特定运动并发症亚型（尤其是异动症）的可靠生物标志物仍然缺乏，区分剂末现象与异动症表型的分子决定因素尚未明确。

线粒体质量控制系统（mitochondrial quality control, MQC）受损——涵盖线粒体生物发生、动力学和线粒体自噬——已成为连接细胞应激与PD神经元易感性的关键机制。在MQC网络中，线粒体自噬和线粒体未折叠蛋白反应（mitochondrial unfolded protein response, UPR^mt）在维持线粒体稳态中发挥核心作用。线粒体自噬由PINK1-Parkin通路调控，选择性通过自噬降解清除受损线粒体。该通路与PD发病机制密切相关：PINK1（一种在去极化线粒体上累积的丝氨酸/苏氨酸激酶）和Parkin（一种对线粒体底物进行泛素化以启动清除的E3泛素连接酶）的突变是家族性早发性PD的公认病因。线粒体磷酸酶PGAM5作为该通路的另一调节因子，参与线粒体自噬和细胞死亡信号传导，并通过Drp1磷酸化调节线粒体分裂。UPR^mt由线粒体蛋白毒性应激触发，通过ATF4、ATF5和CHOP等转录因子上调分子伴侣和蛋白酶以恢复蛋白质稳态。

既往研究已发现PD患者外周血单个核细胞（PBMCs）中线粒体DNA损伤升高，血液转录组分析识别出MQC通路基因是运动进展的强预测因子。研究人员此前已证明线粒体自噬相关蛋白（mitophagy-associated proteins, MAPs，包括PINK1、Parkin和PGAM5）可在血浆中检测到，并能区分PD患者与健康对照。然而，这些血浆标志物及UPR^mt相关转录因子（ATF4、ATF5和CHOP）是否与特定运动并发症亚型（剂末现象和异动症）相关，此前尚未阐明。

基于上述背景，本研究旨在：首先检验这些线粒体自噬和UPR^mt标志物的血浆水平在伴有与不伴有运动并发症的PD患者之间是否存在差异；其次，评估这些标志物在剂末现象与异动症两种运动并发症亚型之间是否存在差异，以识别与异动症（相对于剂末现象）相关的信号；最后，在重叠亚组中探索性评估多标志物组合区分异动症与非异动症的判别能力，作为内部一致性分析。

二、主要技术方法

本研究为单中心横断面研究，经温州医科大学附属第一医院伦理委员会批准。研究对象为2021年1月至2023年12月期间在该院连续招募的PD患者，依据运动障碍学会（Movement Disorder Society, MDS）临床诊断标准确诊。初始评估333例患者，最终纳入247例。排除标准包括：UPDRS IV数据不完整（74例）、年龄>80岁（10例）以及病程>20年（2例）。患者被分为三个分析集：发现集1（线粒体自噬，n=174）、发现集2（UPR^mt，n=179），以及重叠亚组（全部生物标志物，n=106），后者为两个发现集的交集，用于内部一致性分析。

血浆PINK1、Parkin、PGAM5、ATF4、ATF5和CHOP浓度采用商业酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒检测，所有样本在19个独立批次中由对临床数据设盲的实验技术人员测定。为减少跨批次技术变异，在每个发现集内分别进行ComBat批次效应校正。统计分析采用偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis, PLS-DA）识别区分组别的关键临床特征，多变量逻辑回归评估单个生物标志物与运动并发症或异动症状态的关联，最小绝对收缩和选择算子（least absolute shrinkage and selection operator, LASSO）回归用于变量筛选和模型构建，受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线分析评估判别性能，1000次bootstrap重采样评估模型稳定性，Hosmer-Lemeshow检验和校准图评估模型校准，决策曲线分析（decision curve analysis, DCA）评估净获益，限制性立方样条（restricted cubic spline, RCS）函数拟合探索生物标志物与异动症状态之间的非线性关系。

三、研究结果

3.1 血浆线粒体自噬和UPR^mt标志物不能区分伴有运动并发症的PD患者

在主要分析前，使用ComBat校正19个独立ELISA批次效应，六种生物标志物的变异系数均显著降低。在发现集1中，四种线粒体自噬标志物（PINK1、Parkin、PGAM5和PINK1/Parkin比值）在运动并发症（n=77）与无运动并发症（n=97）患者之间均无显著差异。在发现集2中，五种UPR^mt标志物（ATF4、ATF5、CHOP、ATF4/CHOP和ATF5/CHOP比值）在运动并发症（n=72）与无运动并发症（n=107）患者之间同样无显著差异。原始分析中PGAM5与运动并发症状态呈名义关联，但该关联未通过批次校正。PLS-DA识别出区分运动并发症与无运动并发症患者的临床特征，多变量逻辑回归在校正PLS衍生临床成分后，两个发现集中均无任何标志物与运动并发症状态显著相关。

3.2 PINK1/Parkin比值与线粒体自噬发现集中的异动症相关

将发现集1中的运动并发症患者按异动症状态分层（21例异动症 vs 56例剂末现象），单变量分析显示异动症组PINK1水平较高（p=0.018）、Parkin水平较低（p=0.042）、PINK1/Parkin比值升高（p=0.001），而PGAM5无组间差异。PLS-DA识别出嗅觉减退、UPDRS总分、UPDRS第二部分和Hoehn-Yahr分期为区分异动症与剂末现象的临床特征。经PLS衍生临床成分校正后，多变量逻辑回归显示PINK1/Parkin比值仍与异动症状态相关（OR=2.06，95% CI: 1.07–4.44，p=0.044）。进一步校正年龄、性别、左旋多巴等效日剂量（levodopa equivalent daily dose, LEDD）和病程的敏感性分析中，该关联仍显著（OR=2.75，95% CI: 1.28–5.91，p=0.009）。ROC分析显示PINK1/Parkin比值具有中等判别能力（AUC=0.741），高于PINK1单独使用（AUC=0.676）。LASSO回归选择了一个包含UPDRS总分和PINK1/Parkin比值的简约双变量模型，AUC为0.78，bootstrap重采样显示适度的内部稳定性。

3.3 ATF5与UPR^mt发现集中的异动症相关

在发现集2中，异动症患者（n=22）的ATF5水平显著高于剂末现象患者（n=50）（p=0.014），而ATF4、CHOP及其比值在组间无差异。该ATF5关联在批次校正后被观察到，而原始分析不显著。校正饮酒状态和日常生活活动能力（activities of daily living, ADL）后，多变量逻辑回归显示ATF5仍与异动症状态相关（OR=2.27，95% CI: 1.25–4.38，p=0.010）。进一步校正年龄、性别、LEDD和病程的敏感性分析中，该关联仍显著（OR=2.348，95% CI: 1.207–4.990，p=0.017）。ROC分析显示ATF5的AUC为0.673。LASSO回归在λ.min解下产生包含ATF5、ADL和饮酒状态的三变量模型，AUC为0.79，bootstrap重采样显示ΔAUC为0.12。

3.4 重叠亚组中用于区分异动症的三生物标志物组合

在重叠亚组（52例运动并发症患者：16例异动症，36例剂末现象）中，单变量分析显示异动症患者PINK1和PINK1/Parkin比值显著升高（均p<0.01），ATF5呈类似趋势（p=0.052）。ROC分析显示PINK1/Parkin比值的个体AUC最高（0.76），其次为PINK1（0.74）和ATF5（0.67），三者组合的AUC提高至0.82。LASSO回归在λ.min和λ.1se下均选择全部三个生物标志物（PINK1、PINK1/Parkin比值、ATF5），最优截断值下敏感性75.0%、特异性83.3%。bootstrap重采样显示乐观度估计ΔAUC=0.10。三生物标志物模型未显示校准不良证据，决策曲线分析仅在有限阈值概率范围内提示潜在净获益。基于三个LASSO选择的生物标志物构建了用于估计prevalent异动症概率的列线图，临床应用前需外部验证。

3.5 生物标志物显示通路内相关性、通路特异性模式和不同的临床关联

在线粒体自噬通路内，PGAM5与PINK1在全部运动并发症组呈弱负相关（r=-0.25），在异动症患者中呈中等负相关（r=-0.51）。在UPR^mt通路内，ATF4与ATF5在全部组别中呈弱至中等正相关，ATF5与CHOP亦呈正相关。整合分析显示三个核心生物标志物与大多数其他标志物之间缺乏显著的跨通路相关性，唯一例外是全部运动并发症组中PINK1/Parkin与ATF4/CHOP之间的弱正相关（r=0.31）。未观察到线粒体自噬与UPR^mt标志物之间对异动症状态的显著交互作用。三个核心生物标志物均与异动症状态呈显著正相关，此外的临床相关性大多不显著，唯一例外是异动症亚组中PINK1与嗅觉减退之间的正相关。

3.6 候选生物标志物与异动症状态呈非线性关联

生物标志物水平在无运动并发症、剂末现象和异动症三组间总体呈剂末现象最低、异动症最高、无运动并发症居中。发现集中PINK1/Parkin比值和ATF5显示显著总体差异，异动症患者水平高于剂末现象。限制性立方样条分析显示PINK1和PINK1/Parkin比值在发现集中存在非线性关联证据，ATF5呈临界趋势；重叠亚组中PINK1和ATF5显示显著非线性，PINK1/Parkin比值呈类似趋势。二次项分析表明这些关系大体为单调性而无明确阈值。纯异动症、异动症合并剂末现象与剂末现象三组比较显示，PINK1和PINK1/Parkin比值呈显著的异动症>异动症合并剂末现象>剂末现象模式，ATF5呈一致但非显著的梯度。

四、讨论与结论

本研究首次将线粒体自噬和UPR^mt通路标志物作为运动并发症（尤其是异动症）的潜在生物标志物进行探究。尽管两条通路的标志物均不能区分运动并发症与无运动并发症患者，但当分析限定于异动症时出现了通路特异性信号：PINK1/Parkin比值（线粒体自噬）和ATF5（UPR^mt）与异动症相关。三标志物组合（PINK1、PINK1/Parkin比值和ATF5）在重叠亚组中达到中等判别性能。

异动症的病理生理涉及纹状体适应不良的可塑性和间歇性多巴胺能刺激，氧化应激、多巴胺氧化和线粒体功能障碍均有贡献。异动症患者中PINK1升高和Parkin降低的并存可能反映PINK1/Parkin平衡的改变，功能失调线粒体的累积可能促进多巴胺能系统的氧化应激和多巴胺氧化，形成对黑质纹状体通路尤为有害的正反馈循环，可能降低左旋多巴诱导异动症的阈值。ATF5是介导哺乳动物UPR^mt的转录因子，其过表达在PD细胞模型中已被证明可对抗MPP⁺诱导的毒性。仅ATF5而非ATF4或CHOP与异动症相关，与ATF5作为UPR^mt特异性线粒体靶向转录因子而ATF4和CHOP更广泛参与整合应激反应一致。

生物标志物水平在剂末现象中最低、异动症中最高、无运动并发症居中。由于剂末现象和异动症的潜在病理生理不同，将其合并为运动并发症组可能稀释异动症特异性信号，这解释了为何两条通路在主要分析中均不能区分运动并发症与无运动并发症。异动症>异动症合并剂末现象>剂末现象的模式提示这些生物标志物可能反映异动症亚组间MQC相关变化的梯度。生物标志物与传统临床变量之间的有限相关性符合分子生物标志物常提供与临床量表正交信息的认识。

研究局限性包括：未进行PD相关突变基因检测；横断面设计和单中心招募无法推断因果关系和预测未来运动并发症；异动症患者数量较少限制了统计效能和模型稳定性；治疗持续时间和累积左旋多巴暴露数据不可用；排除年龄>80岁和病程>20年的患者限制了普适性；外周血测量可能无法完全反映中枢神经系统的线粒体应激；血样采集和临床评估在药物状态方面未统一标准化；列线图基于ComBat校正值构建，未来应用需标准化测量方案。

结论：本研究表明PINK1、PINK1/Parkin比值和ATF5是与PD异动症相关的候选生物标志物。三生物标志物组合达到中等判别性能，可能有助于估计prevalent异动症的概率。线粒体自噬和UPR^mt标志物均与异动症相关，支持循环MQC标志物与prevalent异动症之间的关联。这些发现为机制研究提供了依据，并需在更大规模、纵向队列中验证以检验因果关系和临床相关性。