《Neurochemistry International》：Synucleins deficiency alter dopamine- and glutamate-induced calcium signal in neurons and astrocytes
编辑推荐：
：
突触核蛋白家族（Synucleins）包括α-、β-和γ-突触核蛋白，广泛分布于机体大部分组织中，在大脑中的作用尤为显著，参与突触囊泡形成、信号转导及线粒体功能调控。聚集的α-突触核蛋白（α-synuclein）形成路易小体（Lewy body），这是帕金
：
突触核蛋白家族（Synucleins）包括α-、β-和γ-突触核蛋白，广泛分布于机体大部分组织中，在大脑中的作用尤为显著，参与突触囊泡形成、信号转导及线粒体功能调控。聚集的α-突触核蛋白（α-synuclein）形成路易小体（Lewy body），这是帕金森病（Parkinson's disease, PD）的组织病理学特征，在神经退行性变机制中发挥关键作用。重要的是，在帕金森病中，多巴胺能神经元的丢失导致多巴胺缺乏，而突触核蛋白已被证明参与多巴胺代谢。神经递质和神经调质多巴胺在大脑中发挥多种作用，其中一个主要新兴功能是调节纹状体、皮层和海马的突触可塑性。多巴胺水平或多巴胺受体的变化可导致多种神经或精神疾病。多巴胺通过多巴胺受体在神经元中诱导钙信号，主要通过D1受体和磷脂酶C（phospholipase C, PLC）相关机制发挥作用。D2样受体主要发挥调节作用，抑制通过谷氨酸受体的信号传导，这有助于保护神经元免受谷氨酸兴奋性毒性损伤，并控制自发性钙振荡。多巴胺可在神经元中诱导非受体依赖性钙信号（通过去极化和电压依赖性钙通道的激活），也可在星形胶质细胞中诱导此类信号（通过激活单胺氧化酶（monoamine oxidase, MAO）、产生过氧化氢和激活磷脂酶C）。尽管突触核蛋白在多巴胺代谢中的作用已被证实，但其作用机制以及突触核蛋白缺失如何改变神经元和胶质细胞中多巴胺诱导的钙信号仍不清楚。
研究人员利用来自α-、β-和γ-突触核蛋白缺陷转基因小鼠的急性脑片，研究了突触核蛋白缺失对神经元和星形胶质细胞中多巴胺和谷氨酸诱导钙信号的影响。研究发现，α-和γ-突触核蛋白缺陷导致多巴胺和谷氨酸诱导的钙信号振幅降低，这可能降低D1型受体的活性。在γ-或αβγ-突触核蛋白敲除（knockout, KO）小鼠的脑片神经元中，多巴胺降低谷氨酸诱导钙信号的能力发生改变，这可能提示D2型受体调控的过程发生变化。有趣的是，α-突触核蛋白敲除在星形胶质细胞中诱导更高的多巴胺诱导钙信号，提示这些细胞中MAO活性更高。突触核蛋白缺陷细胞中钙信号的差异并非由于线粒体钙处理的变化，因为线粒体钙容量和Ca2+外流未改变，仅在γ-突触核蛋白敲除的分离线粒体中观察到线粒体Ca2+摄取速率较慢。
一、研究背景与科学问题
突触核蛋白家族（Synucleins）包括α-、β-和γ-突触核蛋白三种亚型，广泛分布于机体各组织，在大脑中的功能尤为突出，参与突触囊泡形成、信号转导和线粒体功能调控。聚集的α-突触核蛋白形成路易小体，是帕金森病的组织病理学标志，在神经退行性变机制中发挥关键作用。帕金森病中多巴胺能神经元丢失导致多巴胺缺乏，而突触核蛋白已被证实参与多巴胺代谢调控。多巴胺作为重要的神经递质和神经调质，通过D1受体和磷脂酶C相关机制在神经元中诱导钙信号，D2样受体则发挥调节作用，抑制谷氨酸受体信号传导，从而保护神经元免受谷氨酸兴奋性毒性损伤。尽管突触核蛋白在多巴胺代谢中的作用已有报道，但其缺乏如何具体改变神经元和胶质细胞中多巴胺和谷氨酸诱导的钙信号，相关机制仍不清楚。本研究旨在利用突触核蛋白家族缺陷的转基因小鼠急性脑片模型，系统探究突触核蛋白缺失对多巴胺和谷氨酸诱导钙信号的影响及其潜在机制。
二、研究设计与技术方法
研究人员使用成年C57BL/6J野生型（wild-type, WT）小鼠及携带α-、β-、γ-单基因敲除和αβγ三基因敲除的转基因小鼠，小鼠均回交至C57BL/6J背景，来源于IPAC RAS生物资源库和集体使用中心（FFSG-2024-0020）。实验动物为24-32周龄、雌雄兼有，在SPF条件下饲养。主要技术方法包括：急性脑片制备（取感觉运动皮层冠状切片，厚度200 μm）；钙成像技术（采用X-Rhod-1 AM荧光指示剂负载脑片，激光扫描共聚焦显微镜进行时间序列成像，激发波长561 nm，每10秒采集一帧）；药理学实验方案（两种不同给药顺序的方案，分别施加多巴胺50 μM、谷氨酸10 μM、ATP 100 μM和KCl 50 mM，用于区分神经元和星形胶质细胞）；脑线粒体分离（差速离心法结合毛地黄皂苷处理）；线粒体钙保留能力（calcium retention capacity, CRC）评估（使用Calcium Green-5N荧光染料）；线粒体钙内流和外流速率测定。统计分析采用线性混合效应模型、线性回归和Mann-Whitney U检验等方法。
三、研究结果
3.1 突触核蛋白缺失降低神经元和星形胶质细胞的基础钙水平
研究人员通过钙成像检测发现，β-敲除（83±4%）和αβγ-三敲除（69.3±5%）星形胶质细胞的静息钙水平显著低于WT对照；神经元中仅αβγ-三敲除组的基础细胞内钙浓度较对照组低约15%（85±6%），提示钙ATP酶活性增强或主要钙转运体（包括谷氨酸受体）受到抑制。
3.2 α-或γ-突触核蛋白缺失降低神经元中多巴胺诱导的钙信号
研究人员向WT和突触核蛋白缺陷小鼠的急性脑片施加50 μM多巴胺。结果显示，WT神经元中多巴胺可诱导钙升高，该信号在α-敲除神经元中显著降低（65.5±3.7%，p<0.01）；β-突触核蛋白缺陷神经元中多巴胺诱导的钙信号反而升高（134.6±11.7%，p<0.05）；γ-敲除和αβγ-敲除神经元中多巴胺诱导的钙信号均显著低于WT（γ-KO为54.5±3.3%，p<0.001；αβγ-KO为45.6±5.1%，p<0.001）。尽管信号振幅存在差异，各基因型中信号形态相似，提示机制相似。
3.3 突触核蛋白缺失降低神经元中谷氨酸诱导的钙信号
研究人员应用10 μM谷氨酸（生理浓度）检测神经元反应。α-突触核蛋白敲除神经元中谷氨酸诱导的钙信号振幅与WT相当（93.1±11.7%）；γ-突触核蛋白敲除细胞对谷氨酸的反应显著低于WT神经元（34.4±6.5%，p<0.05）；全部突触核蛋白缺失（αβγ-KO）导致谷氨酸诱导的钙信号较WT显著降低（28.7±6.0%，p<0.05）。上述结果表明γ-和αβγ-突触核蛋白敲除导致神经元谷氨酸反应改变。
3.4 多巴胺减弱神经元中谷氨酸诱导的钙信号：突触核蛋白缺失的影响
研究人员检测多巴胺预处理对谷氨酸诱导钙信号的影响。WT脑片神经元中，多巴胺后施加谷氨酸使钙升高显著降低（32.2±2.7%，p<0.0001）；α-突触核蛋白缺陷神经元中多巴胺同样显著降低谷氨酸反应（25.3±2.4%，p<0.0001）；然而在γ-突触核蛋白缺陷神经元中，多巴胺孵育未改变谷氨酸效应（40.9±7.9%）；αβγ-突触核蛋白敲除神经元对多巴胺和谷氨酸均有反应，但多巴胺未降低谷氨酸诱导的钙升高（65.1±17.4%）。该结果提示γ-和αβγ-突触核蛋白敲除神经元中D2受体功能可能较WT或α-突触核蛋白神经元降低。
3.5 星形胶质细胞中多巴胺诱导的钙信号
研究人员发现，MAO抑制剂司来吉兰（selegiline，20 μM）可阻断星形胶质细胞中多巴胺诱导的钙信号，但不影响神经元。各基因型星形胶质细胞对多巴胺均有钙信号反应，WT、β-、γ-和αβγ-敲除组的钙信号振幅无差异。然而与神经元相反，α-突触核蛋白缺陷星形胶质细胞对多巴胺的钙反应显著升高（183.2±23.5%，p<0.05），可能归因于α-突触核蛋白缺陷细胞中MAO活性较高。
3.6 突触核蛋白缺失中的线粒体钙摄取
研究人员利用分离的脑线粒体进行功能检测。α-突触核蛋白敲除未引起CRC（106.6±6.2%）、钙外流（1.32±0.25）或钙摄取速率（-5.03±0.40）的显著变化。γ-敲除动物来源的线粒体CRC较WT降低（84.7±5.7%，p<0.05），钙摄取速率降低（-4.02±0.46，p<0.01），钙外流未改变（1.22±0.17）。αβγ-三敲除导致CRC增加约28%（128.2±8.0%），但对线粒体钙内流（-6.73±0.29）和外流（1.45±0.22）无显著影响。
四、讨论与结论
本研究表明，突触核蛋白在调控多巴胺受体功能和多巴胺代谢中发挥重要作用，进而影响细胞内信号传导机制。γ-和αβγ-敲除显著降低神经元中谷氨酸诱导的钙信号，该效应并非由线粒体钙缓冲所致，可能涉及对受体的直接影响。γ-突触核蛋白敲除线粒体钙摄取抑制和钙容量降低，可能解释γ-突触核蛋白缺失小鼠黑质多巴胺能神经元的显著缺失及寿命缩短。α-或γ-突触核蛋白敲除神经元中多巴胺诱导钙信号的降低，可能归因于突触核蛋白缺乏对D1样受体或单胺转运体的影响。γ-和αβγ-突触核蛋白敲除阻断多巴胺对谷氨酸诱导钙信号的抑制效应，提示突触核蛋白可能影响D2样受体功能。α-突触核蛋白缺陷星形胶质细胞中多巴胺诱导钙信号增强，可能反映MAO表达或活性升高，与MAO-B表达和活性依赖α-突触核蛋白存在的报道一致。综上，突触核蛋白通过调控多巴胺受体和多巴胺代谢，在神经元和星形胶质细胞的钙信号调控中发挥关键作用。
