《Molecular Ecology Resources》：Simplifying Macroinvertebrate Biodiversity Assessment: A Standardised Metabarcoding Method for Invertebrate Samples With High Volumes of Debris
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对淡水大型无脊椎动物（macroinvertebrate）样本进行DNA宏条形码（DNA metabarcoding）分析能够快速、准确地鉴定物种多样性。对大型无脊椎动物未从网具内容物中分离的样本进行处理，可显著降低时间和成本。研究人员设计并检验了一种标准化方
对淡水大型无脊椎动物（macroinvertebrate）样本进行DNA宏条形码（DNA metabarcoding）分析能够快速、准确地鉴定物种多样性。对大型无脊椎动物未从网具内容物中分离的样本进行处理，可显著降低时间和成本。研究人员设计并检验了一种标准化方法，用于处理合并的踢网/扫网样本（kick/sweep samples），并通过DNA宏条形码提供大型无脊椎动物物种多样性的准确估计。研究人员从大墨尔本地区10个站点采集踢网和扫网样本，这些站点已知在流域土地利用、大型无脊椎动物丰度和多样性以及采样碎屑类型和体积方面存在差异。研究人员开发了筛分、混匀和DNA提取方案，以减少样品中的大型碎屑、岩石和砂，并富集大型无脊椎动物用于宏条形码分析。将来自每个站点的样品干重的不同百分比用作宏条形码分析的DNA来源。研究人员发现，当处理不同百分比（20%–40%）的干重时，回收的大型无脊椎动物物种多样性大多一致，但对于总干重低的样品，建议设定最低干重。研究人员提出了一种包含实验室和生物信息学工作流程的方法，能够经济可靠地处理大体积样品，如淡水生物评估中遇到的样品。该宏条形码方法有潜力应用于任何未将无脊椎动物与采样碎屑分离的无脊椎动物生物多样性分析，无论体积和组成如何，并可用于物种丰度、多样性和密度不同的样品。
论文主体解读
研究背景：DNA宏条形码（DNA metabarcoding，基于高通量测序的混合样本物种鉴定技术）已用于淡水大型无脊椎动物（macroinvertebrate，可被网具截留的水生无脊椎动物）物种级鉴定。相关方法可大致分为分选组织法（tissue-based）、未分选散装法（bulk）和环境DNA（eDNA，environmental DNA，从水或沉积物中提取DNA）法。网采组织法与形态学结果高度重叠，散装法也观察到类似格局；eDNA与网采样品所得物种组成和生物多样性指标重叠通常较低，而网采样品常检测到更高的原位大型无脊椎动物生物多样性。DNA宏条形码成本已低于传统方法，若样品在宏条形码前不分选，成本可进一步降低。分选可去除非靶标类群和碎屑，并可调整类群相对丰度，但耗时、费力且需要专业能力。已有散装研究多基于踢网或扫网样品，或使用混合匀浆小亚样、筛分减少扫网体积等策略，但尚未系统评估合并踢网/扫网、含高体积碎屑的大样品需要处理多少未分选材料才能可靠评估生物多样性。因此，研究人员开发并改进标准化处理方案。
研究人员开展的研究：研究人员在大墨尔本地区选择10个站点，基于 Melbourne Water 长期监测数据，覆盖高/低丰度、高/低丰富度、城市/森林/乡村及不同碎屑组成和体积。采集边缘/水塘和急流栖息地的扫网和踢网样品，保留全部材料，乙醇保存并更换至浓度大于80%，4°C储存。研究人员开发筛分、洗脱、混匀、干燥、亚样、DNA提取、DNA宏条形码和生物信息学流程，并按样品总干重取10%、20%、30%、40%亚样。结论是，不同亚样百分比对多样性检测影响有限，20%–30%较稳定，低总干重样品需设定最低干重；该方案可低成本、可靠处理大体积富碎屑样品，适用于未分离碎屑的无脊椎动物生物多样性分析。
关键技术方法：样本队列来源于大墨尔本10个站点，基于 Melbourne Water 长期监测数据。主要关键方法包括：将扫网和踢网样品合并，经8 mm、4.75 mm和250 μm三级筛分去除砂石、大木屑和有机碎屑，富集大型无脊椎动物；混合匀浆并干燥，按总干重取10%、20%、30%、40%亚样；提取DNA后，两轮PCR扩增线粒体细胞色素c氧化酶亚基I（COI，cytochrome c oxidase subunit I）条形码区，用Illumina MiSeq测序；以QIIME2、VSEARCH、DADA2和LULU等完成扩增子序列变异（ASV，amplicon sequence variant）推断、去噪、嵌合体去除和分类；用非度量多维尺度（NMDS，non-metric multidimensional scaling）和中心对数比（CLR，centred log-ratio）分析群落。
研究结果：
3.1 DNA宏条形码：MiSeq文库为19.2 ng/μL，获得5,488,171条高质量序列，每站每亚样超过76,500条。三个亚样因读长不足重跑。掺入对照（spike control）未检出，组成对照（composition control）检测到所有预期物种；负对照仅一个ASV（Poterioochromonas malhamensis），未出现在任何样品中且非研究类群，被视为孤立伪影。稀化分析显示测序深度足够。71%的ASVs在两次PCR重复中均出现，按物种检测计为93%。共3987个ASVs，代表565种178科；淡水大型无脊椎动物占35%的ASVs和86%的reads，其他无脊椎动物占16%的ASVs和5.8%的reads，未分配ASVs占11%但reads仅2.6%。42%的ASVs和90%的reads可种级鉴定；淡水大型无脊椎动物中93%的ASVs和99%的reads可种级鉴定。10站点共378种85科。高丰富度站点物种和科显著多于低丰富度站点（Welch two-sample t-test，p<0.001），高/低丰度站点间、丰度类别与总干重间无显著差异；多数站点物种数超过科数两倍。
3.2 不同亚样中DNA宏条形码检测到的大型无脊椎动物物种：10%、20%、30%、40%干重亚样物种重叠大，无单亚样捕获全部物种；各亚样检测67.5%–96.7%的总种。10%和40%变异最大，20%–30%较一致，检测75%–93%。亚样百分比间无显著差异（one-way ANOVA：F
3,36=2.20，p=0.11）。NMDS显示同站点不同亚样群落相似，stress=0.085。部分站点40%亚样物种较少（UYT-199-3、BNY-2904-2、TOO-4270-0）；低干重样品GRD-7562-0和DNG-31881-3处理超过10%后检测物种增加。
3.3 筛分样品的影响：形态学比较未保留材料（洗脱砂、8 mm和4.75 mm筛）与50 mL保留材料（250 μm筛）显示，50 mL亚样科丰富模式类似宏条形码但科数较少。形态有而宏条形码未检出仅3个类群：Dugesiidae（2）和Baetidae（1），不能确定是真实缺失还是缺参考DNA条形码。仅3例大筛中物种未在20%–40%亚样检出，均来自FEH-4184-3：Limoniidae（Clytocosmus helmsi）、Gripopyteriade（Leptoperla primitiva）、Aeshnidae（Austroaeschna atrata）。其他大筛类群均在20%–40%检出，包括Gyrinidae、Atyidae、Parastacidae；这些在10%亚样高读数、20%–40%低读数。四例加入10%亚样但宏条形码未检出：Hymenosomatidae、Syrphidae、Gordiidae。保留样品总干重13.1–118 g；筛分降低干重69%–99%，去除大有机材料使DNA提取样品干重减少31%–80%。
3.4 DNA宏条形码鉴定与过去采集的比较：8/10站点有过去10年形态学数据。NMDS显示宏条形码站点与历史形态站点倾向分组，尽管季节不同（春季与秋季）；高丰富度站点居左，低丰富度站点居右；stress=0.12，表明宏条形码在科水平可恢复与历史形态鉴定相似的群落。
讨论与结论：研究展示稳健标准化流程，处理含可变碎屑和组织的散装样品，整合样品处理、DNA提取、宏条形码和生物信息学分析，可扩展评估不同物种丰度、多样性和样品组成的淡水生物多样性。未分选材料可减少手动分选；两个扩增子脱靶低于3%。常见和丰富科物种在不同亚样百分比中可靠检测，亚样对物种检测和群落结构影响不大，并由与历史形态样品比较和同站点亚样群落相似支持。标准化基于快速生物评估（RBA，rapid bioassessment），合并散装样品后筛分8 mm、4.75 mm和250 μm，减少碎屑并浓缩。多数未分选方法不用筛，但筛分有用且可降低成本。几乎大筛类群均在保留材料中，仅3例错过。大型Atyidae和Parastacidae虽仅加入10%亚样，仍在所有亚样检出，提示DNA浸出或碎片通过250 μm。筛分需确保小动物冲至250 μm；未来可将大筛类群直接加回，但极大型类群需亚样避免主导。合并踢网/扫网可在混合阶段，若需栖息地信息可分开。筛分批量高效，一人每天可筛6–10个样品，混合10–15个样品。大体积DNA提取中，植物提取试剂盒较土壤试剂盒步骤少、成本低，适合未分选样品；KAPA3G聚合酶耐植物抑制剂。处理量需权衡：过少低估多样性，过多不可行且成本高。10%–40%亚样群落结构相似且无显著差异，检测75%–100%物种；低体积样品10%干重检测偏少，建议最低重量。Buchner et al. 曾报道1%踢网样品可检测多数多样性，但低体积踢网-扫网样品需进一步测试。20%和30%亚样平均多样性较高且变异较小，宜作为高体积样品的常规亚样；40%亚样变异较大且物种较少，可能非最优。建议加入混合和DNA提取空白对照、采用双索引。需用不同丰富度、丰度及碎屑类型样品校准最佳处理量。结论翻译：DNA宏条形码可减少水生大型无脊椎动物样品处理时间和成本，并提供精细分类数据，用于大规模生物监测，支持水健康管理和保护优先排序。研究人员开发了处理复杂样品的工作流，并实施确保多用户可重复分析的生物信息学管道。该方法对复杂样品中大型无脊椎动物群落生物多样性评估具有高置信度，配套样品处理和宏条形码方案可适配各种无脊椎动物样品，其中生物体与采样碎屑混合。虽聚焦水生大型无脊椎动物，方法包括样品处理流程和可重复生物信息学管道，可直接适配其他含混合碎屑的无脊椎动物样品，高度适用于跨类群和栖息地生物多样性监测。
