靶向细菌磷酸转移酶系统的糖基化18F-氟脱氧葡萄糖衍生物用于革兰阳性细菌感染选择性PET显像

《Nature Biomedical Engineering》：Selective PET imaging of bacterial infection using a glycosylated 18F-fluorodeoxyglucose-derived tracer

　　

区分细菌感染与非感染性炎症仍具挑战，因为大多数临床影像检测的是宿主炎症反应而非细菌本身。广泛使用的葡萄糖类似物¹⁸F-氟脱氧葡萄糖（¹⁸F-fluorodeoxyglucose，¹⁸F-FDG）会在代谢活跃组织包括免疫细胞中蓄积，导致高背景信号和有限特异性。在此，研究人员报告一种通过利用磷酸转移酶系统（phosphotransferase system，PTS）直接靶向细菌代谢的正电子发射断层显像（positron emission tomography，PET）示踪剂；PTS是一种哺乳动物细胞中不存在的碳水化合物转运通路。对¹⁸F-FDG进行O-糖基化，一步生成烷基葡萄糖苷库（产率33–92%），从而能够快速筛选细菌摄取。体外研究鉴定出一种甲醇衍生的示踪剂，其中β-异头物（β-anomer）通过葡萄糖特异性磷酸转移酶转运体选择性进入葡萄球菌属（Staphylococcus species）。该PET示踪剂在人血清中稳定，在哺乳动物细胞和未感染组织中摄取极低。在小鼠模型中，它检测活革兰阳性感染部位的信号比未感染组织高6倍以上，且不在无菌性炎症中蓄积，并能够监测抗生素治疗反应。

该论文发表于《Nature Biomedical Engineering》。研究背景方面，临床实践中活动性细菌感染的诊断仍面临重大挑战，病毒感染和非感染性疾病常具有相似症状和实验室发现。临床重要的细菌感染常需挽救生命的抗生素治疗，而未感染患者过度使用抗生素会促进抗菌药物耐药和“超级细菌”出现，并可能改变微生物组而带来长期健康后果。诊断细菌感染的金标准是鉴定组织中的微生物，但常需侵入性操作，且微生物实验室周转时间长。影像学越来越多用于感染检查，以定位病变、监测抗微生物治疗反应和计划组织/液体采样，但X线、计算机断层扫描（computed tomography，CT）、超声和磁共振（magnetic resonance，MR）成像常无法区分急性细菌感染与无菌性过程，也常难以识别抗微生物治疗反应。核医学方法如[¹⁸F]FDG-PET、[¹¹¹In]WBC-SPECT和[⁶⁷Ga]citrate-SPECT虽已应用，但主要检测宿主免疫反应而非细菌本身，因此不能区分细菌感染与骨关节炎、类风湿关节炎和其他自身免疫性疾病等无菌性炎症，且在免疫抑制患者中敏感性下降。为解决这些局限，近期感染成像概念转向直接检测病原体，利用细菌特有的代谢通路，包括靶向病原体特异性糖/糖醇代谢、细胞壁成分、叶酸生物合成和铁蓄积通路的PET放射性示踪剂。研究人员进一步聚焦可从常用PET合成子尤其广泛可得的葡萄糖类似物[¹⁸F]FDG按需合成的示踪剂，例如山梨醇衍生的[¹⁸F]FDS、α-连接二糖[¹⁸F]sakebiose和[¹⁸F]trehalose以及β-连接二糖[¹⁸F]cellobiose。本研究基于细菌而非人细胞使用机制不同且不重叠的葡萄糖转运机制，通过[¹⁸F]FDG的O-糖苷化构建细菌靶向示踪剂库，并假设C-1修饰的[¹⁸F]FDG类似物即¹⁸F标记O-葡萄糖苷可作为细菌PTS底物，从而用PET检测体内活细菌。研究人员建立多种¹⁸F标记O-葡萄糖苷的简便合成，证明异头物混合的α,β-Me-2-[¹⁸F]FDG在人病原体金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）中体外蓄积最高，进一步证明异头物纯的β-Me-2-[¹⁸F]FDG是活性成分，并可用标准[¹⁸F]FDG生产流程从β-甲基甘露糖三氟甲磺酸酯前体合成，无需改造现有设备即可在任何PET中心使用。β-异头物满足精确成像人细菌感染的标准：在人和小鼠血清中稳定、未感染组织蓄积低、体外检测多种临床相关革兰阳性细菌、在多个感染模型中检测活动性感染、监测抗生素治疗反应，并依赖细菌PTS系统在S. aureus中蓄积。该方法特别适用于检测和定位临床常见且具有高发病率和死亡率的播散性革兰阳性感染。因此，β-Me-2-[¹⁸F]FDG因诊断性能和放射合成简便性，成为全球范围内对革兰阳性菌所致临床感染成像的明确选择。

关键技术方法方面，研究人员用临床¹⁸F-FDG经Fischer糖苷化一步合成¹⁸F-葡萄糖苷库，并用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）分离α/β异头物；设计β-甲基甘露糖三氟甲磺酸酯前体12，经放射氟化和水解制备β-Me-2-[¹⁸F]FDG，并在GE FASTlab合成器上验证自动化生产。体外采用细菌摄取、热灭活、竞争和代谢抑制剂实验、S. aureus裂解物HPLC分析，以及S. aureus转座子突变体ΔglcA、ΔglcB、ΔglcC、ΔglcU和ΔmanA。体内采用雌性CBA/J小鼠（Jackson Laboratory）和雌性Sprague-Dawley大鼠（Charles River Laboratories）建立肌炎、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）全身炎症、伤口、肺部、椎间盘炎-骨髓炎（vertebral discitis-osteomyelitis，VDO）和菌血症模型，行μPET/CT动态和静态成像、感兴趣区（region of interest，ROI）分析、时间-活性曲线（time–activity curve，TAC）、生物分布、菌落形成单位（colony-forming unit，CFU）测定、剂量估计和蛋白序列比对。临床¹⁸F-FDG由UCSF现场回旋加速器生产，细菌包括临床分离株。

结果部分，第一小标题为“从临床[¹⁸F]FDG放射合成多种2-脱氧-2-[¹⁸F]氟-D-葡萄糖苷”。研究人员将临床[¹⁸F]FDG干燥后与醇/H⁺反应，经Fischer糖苷化获得α,β-烷基葡萄糖苷，产率33–92%，并用HPLC和¹⁹F标准确认身份；[¹⁸F]1和[¹⁸F]2在小鼠和人血清中37°C 4 h无降解。第二小标题为“体外观察到¹⁸F-葡萄糖苷在革兰阳性细菌中高蓄积，且对不同病原体敏感性可调”。体外摄取显示α,β-[¹⁸F]1在S. aureus中最高，并在表皮葡萄球菌（S. epidermidis）高摄取、无乳链球菌（S. agalactiae）和化脓性链球菌（S. pyogenes）中等摄取，而对粪肠球菌（Enterococcus faecalis）和单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）无摄取；热杀细菌无摄取，非放射性[¹⁹F]1阻断降低摄取，表明需活细菌；其摄取模式不同于革兰阴性菌蓄积的[¹⁸F]FDS。第三小标题为“活性异头物β-Me-2-[¹⁸F]FDG的放射合成与现有[¹⁸F]FDG生产设施兼容”。HPLC分离显示β-Me-2-[¹⁸F]FDG在葡萄球菌和链球菌中摄取显著高于α,β混合物，α-Me-2-[¹⁸F]FDG摄取可忽略；从前体12手动合成β-Me-2-[¹⁸F]FDG，放射化学产率74.6±9.4%（衰减校正，n=26），放射化学纯度>99%，40 min内完成；在GE FASTlab上替换前体后产率31.3±5.8%（n=4，衰减校正），纯度>99%，表明兼容现有基础设施。第四小标题为“β-Me-2-[¹⁸F]FDG对所有受试临床金黄色葡萄球菌菌株敏感”。研究人员检测多种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant S. aureus，MRSA）USA100至USA800脉冲场类型，β-Me-2-[¹⁸F]FDG均一致高摄取；[¹⁸F]FDG也摄取但程度低得多；β-Me-2-[¹⁸F]FDG在多种甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（methicillin-susceptible S. aureus，MSSA）、甲氧西林敏感表皮葡萄球菌（MSSE）和万古霉素中介表皮葡萄球菌（VISE）分离株中高且一致摄取，在链球菌临床分离株中也可蓄积但变异性更大，在E. coli和耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）中摄取可忽略。第五小标题为“β-Me-2-[¹⁸F]FDG进入S. aureus需要葡萄糖特异性PTS组分EIICBA^Glc1”。巯基阻断剂para-hydroxymercuribenzoic acid（PHMB）显著抑制[¹⁸F]FDG和β-Me-2-[¹⁸F]FDG摄取，而phlorizin和dapagliflozin无显著抑制；S. aureus裂解物HPLC显示β-Me-2-[¹⁸F]FDG被转化为可能6-磷酸化代谢物，且不与己糖激酶反应；竞争实验显示葡萄糖>8 mM抑制，2-脱氧类似物和β-MG在<2 mM即抑制；转座子突变体中ΔglcA摄取显著降低，而ΔglcB、ΔglcC、ΔglcU和ΔmanA与亲本JE2相似；β-Me-2-[¹⁸F]FDG对S. aureus较E. coli和哺乳动物细胞RAW264.7、Jurkat具高特异性；多种葡萄球菌属摄取明显，但山羊葡萄球菌和头状葡萄球菌较低。第六小标题为“未感染动物中β-Me-2-[¹⁸F]FDG PET显示组织器官摄取低并经尿快速清除”。未感染小鼠动态PET/CT显示示踪剂快速分布至肺、肝、肾后蓄积于膀胱，主要经尿排泄；α,β-Me-2-[¹⁸F]FDG和α,β-Et-2-[¹⁸F]FDG在心脑AUC较高且尿中可见少量[¹⁸F]FDG，而β-Me-2-[¹⁸F]FDG在左心室心肌无明显摄取、体内代谢稳定且尿中无可见[¹⁸F]FDG峰；药代参数T_1/2α为0.48 min，T_1/2β为44.34 min，肾排泄为主；人剂量外推显示膀胱最高，有效剂量按ICRP60和ICRP103模型估算。第七小标题为“β-Me-2-[¹⁸F]FDG PET在体内快速特异识别活细菌”。在LPS全身无菌炎症模型中信号与未感染小鼠相似；在肌炎模型中，活S. aureus、S. epidermidis、S. lugdunensis、S. saprophyticus、S. agalactiae或S. pyogenes接种部位显著蓄积，而热杀细菌无摄取；β-Me-2-[¹⁸F]FDG对S. aureus肌炎和S. epidermidis肌炎的靶/非靶比值分别为6.1±0.7和7.0±0.5，高于异头物混合示踪剂；E. coli接种无摄取；240 min时靶/非靶比值升至14.6±1.5；ΔglcA突变体接种部位摄取显著低于ΔglcB，支持体内依赖glcA。第八小标题为“序贯β-Me-2-[¹⁸F]FDG PET显像可检测双重感染MSSA/MRSA肌炎模型中的治疗反应”。研究人员建立左/右三角肌分别接种MSSA（最低抑菌浓度，minimum inhibitory concentration，MIC=0.25 μg ml^?1）和MRSA（MIC>32 μg ml^?1）模型，用苯唑西林治疗；治疗后MSSA部位摄取显著降低，MRSA部位无降低且感染扩散，CFU显示MSSA部位细菌负荷较MRSA低超过1 log，表明PET可识别有效抗生素治疗反应。第九小标题为“β-Me-2-[¹⁸F]FDG PET可用于识别伤口、肺部和脊柱S. aureus感染”。伤口感染模型中感染组织信号较未感染组织增加近17倍；肺部感染模型中感染肺摄取11.3±2.9 %IDcc^?1，未感染肺为0.6±0.2 %IDcc^?1；VDO大鼠模型中感染椎体水平Co5-6在感染后第2、4、6天持续高信号，第2天增加4.5倍、第4天6.2倍、第6天16倍，并与CT骨破坏共定位，提示连续扩散和脊柱椎间盘炎。第十小标题为“β-Me-2-[¹⁸F]FDG PET描绘S. aureus菌血症的继发感染部位”。菌血症模型中，感染后第1天和第3天多个关键器官信号逐渐升高，第3天在脑、心、肩、肝和髂骨等出现局灶摄取；与[¹⁸F]FDS同日成像相比，β-Me-2-[¹⁸F]FDG可见局灶信号而[¹⁸F]FDS未见；研究人员指出血中细菌和示踪剂动力学改变可能影响解释，但仍支持识别继发感染部位的可行性。

讨论部分总结指出，研究人员发现靶向细菌PTS的PET放射性示踪剂β-Me-2-[¹⁸F]FDG，用于体内敏感且特异地识别革兰阳性病原体。该示踪剂反映核医学感染成像的若干概念转变：从检测宿主代谢转向细菌代谢，使用临床可及的¹⁸F和⁶⁸Ga等核素，以及使用普遍可得的[¹⁸F]FDG作为放射合成前体。β-Me-2-[¹⁸F]FDG规避了化学酶法放射合成中重组蛋白给药相关监管挑战，也避免[¹⁸F]FSK、[¹⁸F]FDM和其他寡糖在人体中的潜在降解途径；其放射合成仅需在广泛可得的[¹⁸F]FDG卡套中更换前体瓶，组件符合USP<823>要求，且有Me-4-[¹⁸F]FDG用于患者的先例，研究人员正准备研究性新药申请以支持首次人体研究。病原体特异性成像有助于识别感染部位、指导干预和治疗持续时间决策及治疗后随访。β-Me-2-[¹⁸F]FDG对革兰阳性菌尤其S. aureus敏感，可作为对革兰阴性菌敏感的[¹⁸F]FDS的临床互补，具体选择可由临床评估、常规微生物分析和实验室参数指导。该示踪剂通过筛选结构相似示踪剂库发现，O-糖苷化可从临床[¹⁸F]FDG直接进行，可能使无¹⁸F生产设施但能接收[¹⁸F]FDG的站点实施PET。活性异头物β-Me-2-[¹⁸F]FDG在葡萄球菌和链球菌中摄取强，而α-异头物摄取可忽略；竞争实验和基因突变体提示其最可能由glcA编码的葡萄糖转运体EIICBA^Glc1摄取。ΔglcA而非ΔglcB突变体摄取显著降低，C-1构型对EIICBA^Glc1关键，2位羟基缺失可能损害经EIICBA^Glc2的摄取。不同葡萄球菌属摄取差异可能反映转运体表达水平或序列变异，未来可结合蛋白表达和结构分析。β-Me-2-[¹⁸F]FDG对多种MRSA临床株敏感，包括SCCmec II和IV，提示可用于医院和社区获得性MRSA。哺乳动物细胞主要依赖葡萄糖转运体（glucose transporter，GLUT）和钠-葡萄糖转运体（sodium–glucose transporter，SGLT）；β-Me-2-[¹⁸F]FDG因C-1和C-2位羟基缺失而不被哺乳动物葡萄糖转运体识别，却仍为原核生物PTS底物，支持其细菌特异性。基于对活细菌的特异性，β-Me-2-[¹⁸F]FDG有望监测抗菌治疗有效性，尤其耐药菌感染，并可能减少抗生素疗程；也可用于抗生素开发中的非侵入性纵向反应监测。识别继发感染部位具有重要临床意义，因为其存在符合更长抗生素疗程标准，而[¹⁸F]FDG PET缺乏微生物特异性。菌血症模型中β-Me-2-[¹⁸F]FDG PET在多个器官显示继发感染部位，但血中细菌和示踪剂动力学变化需要谨慎解释。

结论部分翻译如下：研究人员开发了一种高效O-糖苷化[¹⁸F]FDG的方法，并构建了用于PET的细菌传感器库。研究确立β-Me-2-[¹⁸F]FDG为一种特异且敏感的示踪剂，用于革兰阳性细菌检测（包括葡萄球菌属和链球菌属）以及随访抗生素治疗反应。β-Me-2-[¹⁸F]FDG在多个临床前模型中的评估支持其未来应用于多种复杂且危险的临床感染。近期，从已报道的β-甲基甘露糖三氟甲磺酸酯前体并利用现有基础设施放射合成β-Me-2-[¹⁸F]FDG是优选路线；而未来从[¹⁸F]FDG本身进行放射合成可能使病原体靶向成像方法更广泛传播，目标是开发用于细菌感染快速诊断的真正即时方法。