脑脊液自上而下肽组学揭示多发性硬化与视神经脊髓炎谱系疾病相关的疾病特异性肽段特征及氧化修饰

《PROTEOMICS》：Top-Down CSF Peptidomics Reveals Disease-Associated Peptide Signatures and Oxidative Modifications in Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica Spectrum Disorder

　　

多发性硬化（multiple sclerosis）和视神经脊髓炎谱系疾病（neuromyelitis optica spectrum disorder, NMOSD）是中枢神经系统（CNS）的炎性脱髓鞘疾病，其诊断主要基于临床证据、磁共振成像（MRI）和脑脊液（CSF）分析。现有方法仅能部分揭示疾病相关的生物学过程，因此亟需对CNS来源的分子特征进行更深入的刻画。在本研究中，研究人员对未经治疗的临床孤立综合征（CIS）、复发缓解型多发性硬化（RRMS）、NMOSD患者以及非炎性神经系统对照者的CSF应用了高分辨率自上而下肽组学方法。研究目标是表征其CSF内肽组，揭示常规蛋白质组学方法无法获取的疾病相关蛋白水解重塑和分子特征。研究人员鉴定出381种内源性肽段，其中包括大量此前未报道的序列和氧化翻译后修饰（PTM）。定量分析揭示了CSF内肽组的疾病相关性改变。一种新鉴定的源自分泌粒蛋白-5（secretogranin-5）的C端肽段从CIS到RRMS呈进行性下降，是利用随机森林（RF）分析区分患者的最具信息量的特征。相比之下，NMOSD患者展现出独特的图谱，其特征为广泛的肽段减少和氧化水平降低。总体而言，这些发现支持CSF内肽组作为一个与分泌通路改变、PTM和鞘内炎症相关的具有生物学信息价值的分子层面。

论文解读文章

研究背景与科学问题

多发性硬化（multiple sclerosis）和视神经脊髓炎谱系疾病（neuromyelitis optica spectrum disorder, NMOSD）均为中枢神经系统（CNS）的慢性炎性脱髓鞘疾病，临床表现存在重叠，给鉴别诊断带来挑战。当前诊断依赖临床评估、磁共振成像（MRI）及脑脊液（CSF）常规检测，但这些手段对疾病内在病理过程的反映有限。近年来，蛋白水解事件被认为是MS发病机制的重要调节因素，可产生反映CNS内炎症、神经退行性变等进程的生物活性裂解产物。然而，既往蛋白质组学研究大多采用酶解预处理（即自下而上策略），这会破坏天然存在的肽段结构及其翻译后修饰（PTM），从而丢失关于内源性蛋白水解过程和修饰状态的关键信息。针对这一空白，研究人员首次将自上而下（top-down）肽组学策略应用于未经治疗的不同炎性脱髓鞘疾病患者的CSF，旨在直接表征天然内源性肽段图谱，揭示疾病相关的蛋白水解重塑及氧化修饰特征。

研究方法概述

本研究为一项探索性病例对照研究，CSF样本来源于意大利卡利亚里“R. Binaghi”医院多发性硬化中心2022至2024年间采集的生物库标本，所有样本均在治疗前收集。共纳入5组受试者：CIS（n=10）、RRMS按寡克隆带（OCBs）状态分层为阳性组（n=30）和阴性组（n=15）、AQP4-IgG阳性的NMOSD（n=6），以及非特异性（NS）神经系统对照（n=20）。关键技术方法包括：采用高分辨率液相色谱-串联质谱（HPLC-ESI-IT-MS/MS）进行自上而下肽组学分析；利用Proteome Discoverer软件结合SEQUEST HT搜索引擎进行肽段鉴定，并通过无标记定量（LFQ）进行相对定量；运用非参数Mann-Whitney检验和Benjamini-Hochberg法控制错误发现率（FDR）进行差异分析；采用Boruta算法筛选特征肽段并结合随机森林（RF）进行样本分类；通过ProsperousPlus工具预测蛋白酶切位点。

主要研究发现

3.1 内源性CSF肽组特征化

研究人员高置信度鉴定出381种源自69种亲本蛋白的内源性肽段。其中44%的亲本蛋白在CNS表达或与CSF直接相关；亚细胞定位分析显示69%为分泌或胞外蛋白。功能富集分析揭示这些蛋白显著富集于激素分泌、细胞间信号传导、纤溶及肽酶活性负调控等生物学过程。值得注意的是，60%的肽段与已有CSF内肽组数据库重叠，其余40%为新发现的天然肽段，其中62种携带至少一种PTM，包括甲硫氨酸氧化（58%）、丝/酪氨酸磷酸化（25%）、半胱氨酸氧化修饰（11%）及赖氨酸乙酰化（8%）。

3.2 患者组间肽组定量比较

与NS对照组相比，CIS和RRMS患者表现出大体一致的肽段丰度变化趋势，且差异的显著性沿CIS→RRMS OCB阴性→RRMS OCB阳性方向递增。下调肽段主要源自分泌粒蛋白-1（secretogranin-1）、骨桥蛋白（osteopontin）和分泌粒蛋白-5（secretogranin-5）；上调肽段则主要来自纤维蛋白原α链（fibrinogen alpha chain）。在CIS与RRMS的直接比较中，差异肽段数量较少。RRMS OCB阳性与阴性组间有4种肽段显著差异，包括新鉴定的分泌粒蛋白-5 C端肽段P160及携带亚硝基化的胰岛素样生长因子结合蛋白4衍生肽段P337_Nitro。NMOSD患者呈现出截然不同的图谱，表现为广泛肽段下调（近14%的肽段完全未检出）和氧化修饰比例降低，尤其在与RRMS各组对比时，纤维蛋白原α链衍生肽段呈现最大幅度的下调（log?FC达-6至-11）。

3.3 血-CSF屏障通透性与肽组的关系

Spearman相关分析表明，除RRMS OCB阴性组中少数纤维蛋白原α链肽段与QAlb呈正相关外，各临床组内肽段丰度与血-CSF屏障指标（QAlb、QAlb_lim）之间未发现系统性关联。

3.4 内源性蛋白酶的计算预测

蛋白酶预测分析显示，基质金属蛋白酶-2（MMP2）、脑啡肽酶（MME）、内皮素转化酶1（ECE1）和激素原转化酶2（PCSK2）是与观察到的肽段切割事件最常关联的蛋白酶。在NMOSD组缺失的肽段中，由PCSK2、MMP2和MME介导的切割事件占比最高，提示这些酶类活性在该病中存在选择性异常。

3.5 随机森林分类

基于Boruta算法筛选出的40种肽段，RF模型实现了近乎完美的五组分类（仅CIS组有2例错分）。用于区分RRMS OCB状态时，仅需9种肽段即可达到完美分类。在所有分类任务中，新鉴定的分泌粒蛋白-5 C端肽段P160均排名首位。此外，三种携带半胱氨酸氧化修饰的肽段（P339_Glut_Nitro、P337_Nitro、P338_Cyst）在正确分配患者至相应组别中发挥了重要作用。

结论与讨论

本研究首次应用自上而下肽组学全面表征了CIS、RRMS和NMOSD患者的CSF内源性肽段图谱。结果表明，CSF内肽组是一个结构化的、具有生物学信息价值的分子层面，能够捕捉到传统自下而上蛋白质组学无法获取的蛋白水解加工和PTM信息。研究得出以下核心结论：

1. 1.
   颗粒蛋白家族（granin family）衍生肽段的显著改变是MS和NMOSD的共同特征，其中新鉴定的分泌粒蛋白-5 C端肽段P160沿CIS→RRMS OCB阴性→RRMS OCB阳性呈进行性下降，是区分疾病阶段和OCB状态的最重要特征，可能反映了对激素原转化酶2（PCSK2）调节活性的扰动。
2. 2.
   MS与NMOSD展现出截然不同的CSF内肽组图谱：MS（尤其是RRMS）的特征是纤维蛋白原α链肽段显著升高（提示局部蛋白水解活跃和神经炎症）以及氧化修饰肽段的存在；而NMOSD则以广泛的肽段缺失、氧化修饰水平降低以及骨桥蛋白衍生肽段相对于RRMS的升高为特点，支持两者并非同一生物学连续体的观点。
3. 3.
   氧化翻译后修饰（特别是半胱氨酸的亚硝基化和谷胱甘肽化）构成了区分疾病的额外信息层，其中仅在RRMS OCB阳性患者中检出的双重修饰肽段P339_Glut_Nitro，可能与亚硝化应激和谷胱甘肽稳态失衡有关。
4. 4.
   蛋白酶预测分析提示，CSF内肽组是由细胞内/分泌颗粒加工、细胞周/膜脱落和胞外蛋白水解等多区室协调作用的结果，其中PCSK2、MMP2和MME的活性改变可能在NMOSD的肽组异常中扮演关键角色。

综上，CSF内肽组可作为研究炎性脱髓鞘疾病中调控性蛋白水解和氧化还原依赖性改变的互补分子层面，并为未来在独立队列中进行验证提供了候选肽段标志物。