引言
沉香是一种在Aquilaria（桃金娘科）和Gyrinops物种中由于机械损伤或微生物感染而形成的树脂心材。它因其药用价值以及作为香器和香水成分而备受推崇，尤其是在亚洲、中东和欧洲（Naef, 2011; Xu et al., 2013）。沉香的形成是一个独特的生物过程：健康的树木不含树脂；它仅在不同情况下才会产生，例如机械损伤、昆虫侵害或微生物感染之后（Wei et al., 2026; Zhang et al., 2026）。这种树脂的主要活性成分是倍半萜类化合物和2-(2-phenylethyl)chromones（Yang et al., 2021; Li et al., 2025）。这些化合物具有抗氧化、抗菌、神经保护、抗炎和抑制乙酰胆碱酯酶的作用（Yu et al., 2022）。为了模拟自然沉香的形成并增加产量，人们开发了各种人工诱导方法，包括物理损伤（如切割或燃烧）以及外源应用植物防御相关诱导剂，如甲基茉莉酸（MeJA）和乙烯利（EtH）处理（Wu and Yu, 2023; Rong et al., 2024）。
在Aquilaria物种中，普通Aquilaria sinensis及其优良品种‘Qi-Nan’Aquilaria sinensis是中国南部和东南亚经济上最重要的种类（Naef, 2011; Naziz et al., 2019）。在自然条件下，普通Aquilaria sinensis》形成沉香需要相对较长的时间，且每棵树的产量较低，这使得难以满足市场需求（Zhang et al., 2026）。因此，培育出了‘Qi-Nan’Aquilaria sinensis品种，该品种的特点是能够早期、快速且高质量地形成沉香（Wei et al., 2026）。研究表明，‘Qi-Nan’Aquilaria sinensis在光合作用能力、木质部结构和碳利用方面优于普通Aquilaria sinensis。这些特性可能是其沉香产量和油含量较高的原因（Li et al., 2022）。这种明显的表型差异表明这两种遗传材料在分子调控上可能存在差异。因此，准确比较它们之间的基因表达对于理解‘Qi-Nan’Aquilaria sinensis的优良沉香特性至关重要。然而，遗传材料之间的基础生理状态差异可能会使常用的参考基因不可靠，因为已知参考基因的稳定性依赖于具体条件（Kozera and Rapacz, 2013; Ling et al., 2014）。如果一个参考基因本身表达不稳定，可能会掩盖或扭曲真实的分子差异，从而影响比较分析的有效性（Friedrichs et al., 2021; Teixeira et al., 2024）。因此，系统选择在两种遗传材料及多种实验条件下都能稳定表达的参考基因是避免系统误差和确保差异表达分析可靠性的重要前提。这一步骤还有助于从表型研究深入到分子机制，并有助于识别关键的调控靶点。
定量实时PCR（RT-qPCR）因其高灵敏度、特异性、良好的重复性和宽动态范围而被广泛认为是基因表达分析的金标准（Dai et al., 2018; Zhou et al., 2022; Rivera-Silva et al., 2024）。然而，RT-qPCR数据的准确性和可靠性在很大程度上取决于标准化的质量，而标准化又依赖于使用稳定表达的参考基因（Rasheed and Beevy, 2024; Mathabatha F. Maleka and Spies, 2025）。理想情况下，参考基因应在所有实验条件下保持恒定的表达。尽管如此，许多研究表明尚未确定适用于所有物种和所有条件的通用参考基因（Thellin et al., 1999; Jiang et al., 2024; Liu et al., 2024）。传统的管家基因如肌动蛋白（ACT）、微管蛋白（TUB）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）在植物研究中被广泛使用，但它们的表达水平会因物种、组织类型、发育阶段和外部压力而显著变化（Barbierato et al., 2017; Wever et al., 2021; Yao et al., 2022）。忽视参考基因稳定性验证的研究可能会产生有问题的结论，甚至导致错误的生物学解释（Tanaka et al., 2017; Cai et al., 2024; An et al., 2025）。因此，在任何新的实验系统中，尤其是在研究压力诱导的沉香形成时，系统筛选和评估候选参考基因的稳定性是进行可靠基因表达分析的必要前提。
迄今为止，关于Aquilaria物种中与沉香生物合成相关基因的研究已经开始了（Li et al., 2024; Yang et al., 2026）。然而，对于压力条件下基因表达分析所需的参考基因的系统评估仍然不足。特别是对于普通Aquilaria sinensis和‘Qi-Nan’Aquilaria sinensis》这两个关键遗传材料，据我们所知，还没有系统性的研究全面比较过它们在多种压力处理、组织和发育阶段下的表现。这限制了该领域的深入分子研究。即使在亲缘关系密切的品种中，最佳的参考基因组合也可能存在显著差异。例如，Ling等人（Ling et al., 2014）发现不同甘蔗品种和处理方法下最佳的参考基因组合也有很大差异。Kong等人（Kong et al., 2014）在西瓜中也观察到了类似的变化。在一项针对Dendroctonus rufipennis的研究中，参考基因筛选显示RPL32、RPS18和SDHA在发育阶段具有最高的稳定性，而性别和滞育状态显著影响了参考基因的排名（Zhang et al., 2025）。这些研究表明，应该针对每个特定的物种和实验条件系统验证参考基因的选择（Rasheed and Beevy, 2024）。
鉴于普通Aquilaria sinensis和‘Qi-Nan’Aquilaria sinensis在沉香形成方面的表型差异，可靠的参考基因对于比较表达研究至关重要。本研究中使用的‘Qi-Nan’材料是优良的栽培克隆‘Reke 2’（Qiong R-ETS-AS-003-2017），它是通过无性繁殖方法获得的（Wang et al., 2019）。‘Reke 2’材料的真实性已通过DNA条形码技术进行了分子鉴定（Zeng et al., 2021），其特有的沉香化学成分也在先前的研究中得到报道（Yang et al., 2021; Zhang et al., 2023; Zhang et al., 2024）。到目前为止，只有Gao等人（Gao et al., 2012）研究了Aquilaria sinensis中参考基因的适用性，他们在短期压力（2–6小时）下使用了愈伤组织和两年生幼苗。然而，该研究没有涵盖遗传材料比较、长时间过程、多种组织或幼苗盐胁迫。因此，我们的工作不是第一次在Aquilaria中进行参考基因筛选，而是一种系统的比较评估，它扩展了以往的研究，包括：（i）比较普通Aquilaria sinensis与‘Qi-Nan’Aquilaria sinensis遗传材料；（ii）覆盖0–7天的五种压力处理；（iii）包括成熟树木的茎、叶和花组织；（iv）评估在NaCl下的幼苗根、茎和叶。我们选择了十个候选基因，并使用ΔCt、BestKeeper、NormFinder和geNorm对其稳定性进行了评估，并通过RefFinder进行了综合排名。这为特定遗传材料、组织、处理和阶段提供了定制的标准化策略，有助于未来的沉香形成分子研究。
