《Poultry Science》：Integrative transcriptomic analysis reveals tissue associated molecular responses to heat stress in chickens
编辑推荐：
气候变化正在加剧极端高温事件，对家禽健康、福利和生产性能构成威胁。尽管RNA测序（RNA-seq）已被广泛用于研究热应激反应，但单项研究受限于样本量小、实验异质性以及差异表达特征不一致等问题，限制了跨组织保守分子反应的识别。研究人员对11个独立的RNA-seq
气候变化正在加剧极端高温事件，对家禽健康、福利和生产性能构成威胁。尽管RNA测序（RNA-seq）已被广泛用于研究热应激反应，但单项研究受限于样本量小、实验异质性以及差异表达特征不一致等问题，限制了跨组织保守分子反应的识别。研究人员对11个独立的RNA-seq数据集进行了整合分析，共包含212个样本（110个肝脏、62个胸肌和40个心脏），均来自暴露于热应激的肉鸡。研究结合差异表达分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）和多标准共识过滤，以识别交叉验证的核心基因。研究人员鉴定了保守的肝脏、胸肌和心脏转录反应，这些反应表现出明显的组织相关分工模式。肝脏表现出代谢重编程，涉及糖异生和脂肪酸代谢通路的改变，包括PCK1和ACACB，同时伴随胰岛素-过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路的变化。胸肌表现出p53介导的细胞周期阻滞和蛋白质稳态反应，涉及CDKN1A和DNAJA4。心脏表现出肾上腺素能-钙信号通路的转录变化，包括CACNA1H和PPP3CA，同时伴随细胞外基质重塑的抑制。利用decoupleR和直系同源映射的DoRothEA调控子进行的转录因子（TF）活性推断提示了组织相关的调控模式，涉及肝脏中的HSF2、NCOA3和MEF2A/MEF2C；胸肌中的FOXO4、SOX9和SP家族转录因子；以及心脏中MEF2A/MEF2C、TEAD1和JUN活性的降低。这一整合框架识别出经多种分析方法验证的高置信度候选基因和调控网络，为后续家禽气候适应性的基因组和功能研究提供了分子候选靶标。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
随着全球人口预计在2050年接近97亿，家禽作为全球肉类生产占比最大的来源，且在家畜中具有最高的饲料转化效率，其热调节能力在环境温度超过热中性区上限时面临严峻挑战。人为气候变化正使极端高温事件超越历史基线水平，预计在21世纪将进一步加剧。热应激会诱发多个系统的协调生理反应，包括氧化应激、酸碱失衡和免疫功能受损，进而导致饲料效率下降、体重增长减少和死亡率升高。鉴于家禽主产区预计将在本世纪中叶面临不断升级的极端高温暴露，解析热适应性的分子架构已成为紧迫的研究课题。
传统的差异表达分析能够识别热应激与对照条件之间表达变化较大的基因，但无法直接捕获协调的基因网络或共表达基因间的关系。将差异表达分析与加权基因共表达网络分析相结合，可以识别具有统计学显著性和网络支持的基因，从而提高其生物学相关性的可信度。跨研究整合能够在不同实验条件下识别反复出现的转录变化，而无需直接合并生物学上不同的数据集。然而，差异表达和共表达网络分析本身无法解析协调组织相关反应的上游转录调控因子。基于调控子方法的转录因子活性推断，能够重建驱动观察到的表达变化的调控程序，提供超越基因水平变化的机制层面信息。
基于上述背景，本研究提出两个核心问题：第一，哪些保守的组织相关转录程序特征性地构成了鸡对热应激的反应？第二，哪些推断的上游转录因子与这些调控程序相关联？
二、研究内容与意义
本研究对11个独立RNA-seq数据集共212个样本（110个肝脏、62个胸肌和40个心脏）进行了整合分析，构建了肉鸡热应激反应的共识分子图谱。通过将差异表达分析与WGCNA相结合，研究人员识别出在异质实验条件、遗传背景和热应激方案中持续存在的共识转录特征，并进一步利用decoupleR结合DoRothEA调控子数据库推断上游转录因子活性，通过基因集富集分析评估这些推断活性，揭示了组织相关的调控分化。
研究揭示了一种分工模型：肝脏通过PCK1和ACACB抑制糖异生和脂肪生成通路；肌肉通过CDKN1A和DNAJA4激活p53介导的蛋白质稳态维持；心脏通过CACNA1H和PPP3CA维持肾上腺素能-钙信号传导。通过整合差异表达分析、WGCNA和方向一致性分析，研究人员识别出共识核心基因，为鸡气候适应性的后续基因组和功能研究提供了可靠候选靶标。
三、关键技术方法
研究人员从NCBI序列读段档案（SRA）数据库系统检索鸡热应激研究的RNA-seq数据，筛选标准包括：同时具备热应激和对照条件的生物学重复、组织样本为肝脏/心脏/胸肌、实验元数据清晰完整。最终纳入11项独立研究。原始FASTQ文件经FastQC v0.11.9质量评估后，使用STAR v2.7.10a以双通路模式比对至鸡GRCg7b参考基因组，通过DESeq2 v1.34.0对各研究独立进行差异表达分析，采用基于一致性的投票计数方法整合跨研究结果。WGCNA v1.72-1独立应用于各研究内部以构建共表达网络，模块特征基因与热应激状态进行Pearson相关分析。转录因子活性推断采用decoupleR结合DoRothEA人源调控子数据库，通过直系同源映射转换至鸡基因组，使用单变量线性模型（ULM）方法计算活性评分。功能富集分析使用KOBAS进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集，蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络使用STRING v12.0构建。
四、研究结果
跨独立肝脏转录组研究鉴定的保守热应激反应基因
对各独立转录组研究的差异表达分析显示，转录反应的幅度和方向存在显著差异，反映了样本量、热应激方案和品种特异性效应的不同。采用保守的跨研究投票计数方法，肝脏中鉴定出67个保守的差异表达基因（DEGs），代表肝脏应激反应的强候选生物标志物。在灵敏度分析中，采用FDR < 0.05且|log?FC| ≥ 0.5的共同效应阈值后，保守肝脏基因集从67个增加至283个，其中64个原始基因（95.5%）保持严格的跨研究方向一致性。胸肌中有48个基因达到共识标准（29个一致上调，19个一致下调）。相比之下，心脏组织的重叠最少，仅4个基因在跨研究中表现出一致的差异表达，因此将三个心脏DEG集的并集（419个独特基因）单独进行探索性功能表征。
三个组织DEGs的功能富集分析
肝脏下调基因的功能富集分析揭示了能量需求型代谢通路的协调抑制，主要涉及丙酮酸代谢、脂肪因子信号传导和胰岛素-PPAR信号轴；上调基因富集于胰岛素信号通路、内质网蛋白加工和MAPK信号通路。胸肌下调基因主要涉及线粒体氧化磷酸化和线粒体基因组维持；上调基因富集于应激反应激活和细胞周期调控，其中CDKN1A驱动的细胞周期阻滞和热休克蛋白结合蛋白再折叠活动显著，p53信号通路富集以CDKN1A和GADD45B为关键节点。心脏下调基因富集于细胞外基质组织，以多个胶原蛋白（COL4A1、COL4A2）为代表；上调基因富集于钙信号通路和肾上腺素能反应相关通路。
WGCNA鉴定的肝脏、胸肌和心脏关键核心基因
在肝脏中，10个模块与热应激表型名义相关，合并产生220个肝脏相关核心基因。胸肌中鉴定出8个名义热应激相关模块，合并核心基因集为312个基因。心脏组织揭示5个名义热相关模块，产生233个核心基因。这些合并核心基因集的功能富集显示与DEG分析鉴定的组织特异性通路趋同，为已识别的生物学反应程序提供了互补的网络层面支持。
DEGs与模块核心基因的重叠基因
肝脏中DEG-模块重叠包括代谢调控因子PCK1、ACACB和PPP1R3B，以及外源物和氧化应激相关基因。胸肌中重叠集包括蛋白质稳态和细胞周期调控相关基因CDKN1A和DNAJA4，以及脂质代谢和发育候选基因LIPG、SEMA6D和FOXD2。心脏中DEG-模块重叠基因包括GNAQ、GNAI1、PPP3CA、TRPC6等与钙、G蛋白和心血管信号传导相关的基因。这些重叠集代表优先候选基因，供后续功能和基因组研究使用。
网络支持候选基因的功能富集揭示组织相关反应程序
肝脏核心基因富集汇聚于胰岛素-PPAR信号轴，PCK1和ACACB作为连接葡萄糖和脂质代谢的中心节点，同时涉及应激响应性细胞色素（CYP1A1、CYP4B7）和糖原储存调控因子（PPP1R3B/C）。胸肌核心基因富集汇聚于p53介导的细胞周期阻滞（CDKN1A）、伴侣辅助蛋白再折叠（DNAJA4）和脂质分解过程（LIPG）。心脏核心基因富集汇聚于钙信号传导和肾上腺素能反应，关键节点包括钙调磷酸酶调节因子PPP3CA、G蛋白亚基（GNAQ、GNAI1）和钙通道（TRPC6、SNTA1），Apelin信号作为次级调控轴出现。
转录因子活性推断支持肝脏调控模式
在肝脏中，热应激诱导应激响应调控因子的强烈激活：HSF2活性最强（ULM = 9.03），其次为NCOA3（ULM = 6.42）、ARID2（ULM = 4.39）、MEF2A（ULM = 4.33）和MEF2C（ULM = 3.01）。相反，生长相关转录因子MYC（ULM = ?4.48）和FOXP1（ULM = ?6.32）被强烈抑制。相关性分析显示NCOA3和MEF2A/C活性与PCK1及其他代谢调控因子正相关，而MYC与相同基因负相关。GSEA验证显示NCOA3（NES = 2.39，padj = 1.3 × 10?3）、MEF2A（NES = 1.85，padj = 1.3 × 10?3）和MEF2C（NES = 1.54，padj = 1.4 × 10?2）显著正富集，MYC显著负富集（NES = ?1.68，padj = 1.3 × 10?3）。
胸肌中的转录因子活性推断
胸肌中热应激诱导SP1（ULM = 4.68）、SP3（4.40）、TEAD1（4.32）、FOXO4（3.97）和SOX9（3.60）的强烈激活，而脂肪生成调控因子SREBF2（ULM = ?2.82）和增殖性转录因子E2F4（ULM = ?3.65）、MYCN（ULM = ?2.90）被强烈抑制。相关性分析显示FOXO4活性与CDKN1A正相关（ρ = 0.38），与FOXO转录因子诱导CDKN1A介导的细胞周期阻滞和自噬的已知功能一致。GSEA验证显示FOXO4（NES = 1.94）、FOXO1（NES = 1.62）和SOX9（NES = 1.92）正富集趋势。
心脏相关调控网络的转录因子活性推断
心脏组织在热应激下表现出主导性抑制模式，仅4个转录因子被激活（包括RARA和FOXO1），16个被抑制（包括HSF2、TEAD1和MEF2A）。GSEA验证确认MEF2C（NES = ?1.4）、MEF2A（NES = ?1.32）、JUN（NES = ?1.49）和TEAD1（NES = ?1.51）均显著负富集。心脏中MEF2A和MEF2C的主导性抑制与肝脏中的强烈激活形成鲜明对比，揭示了MEF2家族调控部署的组织特异性分化。TEAD1的抑制表明热应激下增殖性和结构性重塑减弱，JUN的抑制反映AP-1相关转录活性降低。
五、讨论总结
肝脏、胸肌和心脏来自不同的实验，因此观察到的模式被描述为组织相关而非组织特异性。肝脏中PCK1和ACACB的协调下调与热应激期间抑制肝脏葡萄糖产生以减少代谢产热的适应性机制一致，PPP1R3B和PPP1R3C的上调表明代谢状态向糖原储存而非糖异生转变。转录因子分析支持HSF2介导的热感知、NCOA3相关的代谢共激活和MEF2钙调节代谢转换共同协调肝脏热适应。胸肌中CDKN1A和GADD45B的存在表明p53转录程序在热应激下保护细胞，使其暂停增殖并将资源用于缓解应激，同时泛素-蛋白酶体通路基因的富集反映了清除热损伤多肽的蛋白质质量控制机制的激活。心脏中钙信号和肾上腺素能信号通路的激活与热应激诱发心肌细胞钙超载的研究一致，而细胞外基质成分的下调与慢性循环热应激抑制组织完整性相关结构基因网络的结果相符。心脏的主导性抑制模式表明其通过组成性钙-肾上腺素能架构维持收缩功能，而非进行新的转录重塑。这些能量重分配模式与人类和实验模型中热应激的保守生存策略一致，在分子水平上支持了一种优先考虑细胞维持和应激适应而非生长的能量重分配策略。
六、研究结论
这项对三个组织RNA-seq数据集的整合分析提供了肉鸡急性热应激反应的系统层面图谱。肝脏通过PCK1和ACACB抑制糖异生和脂肪生成轴；胸肌通过CDKN1A和DNAJA4激活p53介导的细胞周期阻滞和蛋白质稳态维持；心脏通过CACNA1H和PPP3CA维持肾上腺素能-钙信号传导。这些转录程序由不同的上游转录因子协调，包括肝脏中的HSF2、NCOA3和MEF2A/MEF2C，以及肌肉中的FOXO4、SOX9和SP家族成员。这些发现揭示了一种组织相关的分工模式：每个器官部署不同的转录策略应对热应激——肝脏削减能量密集型生物合成，肌肉阻滞增殖并激活蛋白质质量控制，心脏在抑制结构重塑的同时维持收缩功能。这种协调反应代表了一种优先考虑短期生存而非生长的能量重分配策略。优先化的基因和调控网络为在独立群体和受控多组织实验中的后续验证提供了候选靶标，在纳入基因组选择计划或解释为耐热性决定因素之前，需要进行功能研究。
