基于变性-复性多重PCR（drmPCR）的韩国本土鸡种雄性晚羽基因型低成本精准鉴定方法

《Poultry Science》：A Simple and Cost-effective Denaturation–Reannealing Multiplex PCR (drmPCR) Method for Discriminating Late-feathering Genotypes in Male Korean Indigenous Breed Chickens

本研究评估了一种经济有效的变性-复性多重聚合酶链式反应（denaturation–reannealing multiplex PCR, drmPCR）方法，用于韩国本土鸡（Korean Native Chicken, KNC）和韩国乌鸡（Korean Ogye, KO）群体的雄性晚羽（late-feathering, LF）基因分型。所开发的检测方法整合了变性-复性步骤与后续针对LF特异性K-junction及一个PRLR对照的多重扩增。该预处理显著改善了剂量依赖性的条带比率分离，有效将LF雄性KNC和KO个体分类为纯合子（ZK/ZK）或杂合子（ZK/Zk+），尽管有小部分样本无法通过该方法明确分类。然而，与以微滴式数字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）定义的LF基因型模式作为参照相比，drmPCR展现出比标准定量PCR（quantitative PCR, qPCR）更高的准确性。因此，drmPCR为家禽育种中的LF基因分型提供了一种快速、经济高效的一线筛查工具，无需特殊设备或专业技能，非常适合在家禽业中进行大规模LF雄性基因型筛查。

研究背景与问题

在商业家禽生产中，雏鸡性别鉴定直接影响生产效率与经济收益。传统的肛门鉴别法虽然准确率高，但严重依赖专业技术人员的经验，劳动强度大且耗时。羽毛自别雌雄技术作为一种替代方案，利用初生雏鸡翼羽的发育模式差异——早羽（early-feathering, EF）雏鸡的主翼羽长于覆主翼羽，而晚羽（late-feathering, LF）雏鸡的主翼羽长度等于或短于覆主翼羽——来区分性别。这一性状由位于Z染色体上的K等位基因调控，其中LF相关的显性K对EF相关的隐性k?呈显性。K等位基因与Z染色体上约176 kb的串联重复相关，该重复涉及PRLR和SPEF2基因的部分区域，并形成独特的K-junction（dPRLR-dSPEF2），可作为分子标记。

为了持续维持羽毛自别雌雄体系，育种者必须保有纯合的EF父系品系（Z^k+/Z^k+）和纯合的LF雄性品系（Z^K/Z^K）。具体而言，生产后续繁殖所需的LF母鸡需将纯合LF公鸡与EF母鸡杂交。然而，标准PCR虽能区分LF与EF公鸡，却无法区分纯合（Z^K/Z^K）与杂合（Z^K/Z^k+）的LF公鸡。传统测交法因需评估后代表型而不切实际。定量实时PCR（qPCR）和微滴式数字PCR（ddPCR）虽能精确测量K-junction剂量，但其对专用设备和较高分析成本的需求限制了在大规模育种群体中的应用。其他分子方法如PCR-RFLP受限于品种特异性序列变异，而常规多重PCR的电泳读值变异过大，难以进行可靠的剂量依赖性判读。

研究目的与意义

为解决上述问题，研究人员开发并评估了一种变性-复性多重PCR（drmPCR）方法。该方法通过在多重PCR前引入变性-复性步骤，显著改善了K-junction与PRLR内参条带比率的分离度，从而能够清晰、经济地区分LF雄性基因型，无需特殊设备。研究在韩国本土鸡（KNC）群体中以ddPCR定义的LF基因型为参照验证了drmPCR的准确性，并与qPCR进行了比较，同时将其扩展应用于韩国乌鸡（KO）群体，证明了其在多个本土品种中的适用性。drmPCR为识别育种公鸡并维持羽毛自别雌雄品系提供了一个快速、实用的一线筛查框架。

关键技术方法

1. 1.
   K-junction定义模拟实验与drmPCR建立：研究人员利用来自LF母鸡（Z^K/W）和EF母鸡（Z^k+/W）的基因组DNA（gDNA），制备了K-junction比例分别为100%、50%和0%的定义模拟模板。将这些模板分别在不加热和经过变性-复性处理（95°C变性后缓慢降温至25°C复性）后进行多重PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳分析K-junction/PRLR条带比率，以评估变性-复性步骤的效果。引物序列见原文表1。
2. 2.
   ddPCR分析：作为独立的定量参考方法，对所有KNC LF雄性样本进行ddPCR，以确认drmPCR和qPCR的分类结果。对于KO群体，仅对临界或模糊样本进行ddPCR验证。ddPCR使用FAM标记的K-junction探针和HEX标记的PRLR探针，通过QX200?微滴生成仪和读取仪进行绝对定量。
3. 3.
   qPCR分析：使用与ddPCR相同的引物和探针组，在StepOnePlus实时PCR系统上进行双通道TaqMan探针法定量PCR，以计算K-junction的相对剂量（2^-ΔΔCt）。

研究结果

1. 韩国本土鸡群体的羽毛形态学分析

研究人员首先分析了KNC和KO群体的羽毛形态特征。结果显示，两个群体均同时存在EF和LF等位基因。EF雏鸡表现出主翼羽长于覆主翼羽的特征，而LF雏鸡则表现为主翼羽生长延迟，其长度等于或短于覆主翼羽。

2. 变性-复性步骤增强了K-junction定义模拟物中K-junction条带比率的分离

为验证假设，研究人员使用不同比例的K-junction定义模拟模板（100%、50%、0%）进行测试。结果表明，经变性-复性处理后，100%与50%模拟物之间的K-junction/PRLR条带比率差异显著大于未加热对照组。BLASTN分析确认了PRLR扩增子与Gallus gallus PRLR编码序列匹配，K-junction扩增子与dPRLR-dSPEF2融合序列匹配，证实了靶标的特异性。这表明drmPCR能有效增强基于K-junction剂量差异的条带比率分离。

3. 利用drmPCR对KNC和KO的LF纯合与杂合雄性进行分类

研究人员应用drmPCR对64只LF KNC雄性样本进行分类。以ddPCR定义的3个纯合和3个杂合参考样本建立阈值：纯合范围定义为均值减1个标准差（≥0.631），杂合范围定义为均值加1个标准差（≤0.423）。结果显示，12只被归为纯合子，46只为杂合子，6只（占5.2%）落在中间阈值范围内，被归类为临界样本。对于93只LF KO雄性样本，采用相同方法，使用KO特异性的ddPCR参考样本设定阈值（纯合边界0.630，杂合边界0.476），最终47只被归为纯合子，38只为杂合子，8只为临界样本。所有临界样本经ddPCR进一步确认后被归入杂合子组。

4. drmPCR在LF基因型分类中比常规qPCR具有更高准确性

以ddPCR为金标准，drmPCR在区分纯合与杂合样本时显示出比qPCR更高的统计显著性（P<0.001 vs. P<0.01）。更重要的是，drmPCR对64只KNC LF雄性样本的正确分类率达到90.63%（58/64），仅有9.38%的临界率，远优于qPCR的67.19%（43/64）正确率和32.81%的临界率。drmPCR对ddPCR定义的纯合子识别灵敏度为100%（12/12），对杂合子为88.46%（46/52），而qPCR的相应灵敏度仅为75.00%（9/12）和82.69%（43/52）。这证明drmPCR有效克服了传统PCR方法因技术或品种特异性变异导致的不准确性。

讨论与结论

讨论总结：

区分公鸡的LF纯合与杂合基因型对于维持羽毛自别雌雄品系至关重要。以往的方法如qPCR和常规多重PCR存在成本高、需特殊设备或可重复性差等问题。本研究表明，drmPCR通过在PCR前引入变性-复性步骤，可能改变了模板的复性行为、可用性或形成了异源双链构象状态，从而剂量依赖性地增强了K-junction/PRLR条带比率的分离度。与需要昂贵仪器和试剂的qPCR及ddPCR相比，drmPCR仅需热循环仪和琼脂糖凝胶电泳等基础实验室设备，是一种简单、经济的替代方案。它产生的临界样本更少，与ddPCR金标准的符合率更高。研究也存在局限性：变性-复性步骤改善分离度的具体分子机制未被直接表征；KO群体未接受完整的ddPCR验证，未来需在其他独立群体中进行更多验证。

研究结论：

本研究提出并验证了一种简单、经济、实用的drmPCR方法，可作为鉴别公鸡LF基因型的一线筛查工具。该方法无需特殊设备，适用于家禽业大规模育种群体的筛选，有助于为羽毛自别雌雄体系选择正确的育种公鸡，保障该体系的遗传完整性。