肝脏昼夜节律组织丧失在蛋鸡脂肪肝综合征中鉴定CLOCK为脂质稳态调节因子

《Poultry Science》：Loss of hepatic circadian organization in fatty liver syndrome identifies CLOCK as a regulator of lipid homeostasis in laying hens

　　

脂肪肝综合征（FLS）是蛋鸡的一种主要代谢紊乱，但肝脏脂质失调如何与昼夜节律紊乱相联系仍不清楚。在此，研究人员研究了昼夜节律调控在FLS发病机制中的作用，并聚焦核心钟基因Clock Circadian Regulator（CLOCK）。在高脂饮食诱导的罗曼粉蛋鸡FLS模型中，患病鸡表现为肝肿大、肝脏脂质蓄积、血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）升高，肝脏促炎基因表达增加，白细胞介素-10（IL-10）表达降低。FLS还伴随产蛋性能下降、产蛋延迟和分散，以及生殖激素时间谱改变。跨六个昼夜时间点的时序肝脏转录组学显示FLS中广泛的转录重塑，失调基因主要富集于脂质代谢和昼夜节律通路。通路分析表明脂肪酸生物合成增加，同时脂肪酸降解、甘油磷脂代谢和醚脂代谢降低。节律性分析进一步揭示肝脏昼夜节律组织显著崩塌：节律性表达基因数量从对照组的1,046个降至FLS组的81个，包括CLOCK、cryptochrome 2（CRY2）和basic helix-loop-helix family member e40（BHLHE40）在内的核心钟基因失去节律性表达。Series Test of Cluster分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）和蛋白-蛋白互作分析一致地将CLOCK置于与肝脏代谢紊乱相关的昼夜节律调控网络中心。原代鸡肝细胞功能实验显示，CLOCK过表达降低脂质蓄积、细胞内总胆固醇和甘油三酯水平以及脂生成基因表达，同时增加过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）表达并改变多个昼夜节律调节因子。在油酸诱导的脂肪变性模型中，CLOCK过表达同样降低脂质沉积和炎症基因表达，同时增加IL-10、烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）和Sirtuin 1（SIRT1）表达。该研究提供了对FLS昼夜节律基础机制的见解，并强调CLOCK作为家禽代谢性肝病预防和干预的潜在分子靶点。

研究背景与问题：脂肪肝综合征（FLS）是蛋鸡常见代谢紊乱，也是商业鸡群生产力下降和死亡率升高的重要原因。其特征为肝脏脂质代谢失衡、极低密度脂蛋白（VLDL）合成和分泌受损，以及肝细胞甘油三酯（TG）过度蓄积；严重时可导致肝细胞损伤、肝脂肪变性和出血。蛋鸡肝脏是de novo lipogenesis的主要场所，卵巢不能合成卵黄形成所需脂质，故蛋鸡主要依赖肝脏脂质合成与运输维持产蛋。昼夜节律是内源性约24 h振荡，调控采食、内分泌、生殖事件和能量代谢。鸟类核心钟基因包括Clock Circadian Regulator（CLOCK）、period 2（PER2）、period 3（PER3）、basic helix-loop-helix ARNT like 1（BMAL1）、cryptochrome 1（CRY1）和cryptochrome 2（CRY2）。昼夜节律与肝脏代谢紧密相关，脂质合成和周转相关酶及转录因子呈昼夜变化；乙酰辅酶A羧化酶（ACC）和脂肪酸合酶（FAS）是脂肪酸合成关键限速酶，固醇调节元件结合蛋白（SREBPs）和肝X受体是肝脂生成重要转录调节因子。FLS鸡中ACC和FAS表达增加。已有证据表明昼夜节律紊乱与代谢性肝病相关，高脂喂养可重塑肝脏转录和代谢程序并扰乱既有昼夜振荡，CLOCK突变小鼠出现肥胖及血清胆固醇和TG升高。然而，蛋鸡FLS中昼夜节律紊乱是否参与、哪些核心钟调控因子受累仍不清楚。因此，研究人员建立高脂饮食诱导的罗曼粉蛋鸡FLS模型，整合时序肝脏转录组学、节律性分析、网络分析和原代肝细胞功能验证，聚焦CLOCK，以阐明FLS的昼夜节律基础并寻找潜在分子靶点。研究得出：高脂饮食导致FLS，伴随异常脂质沉积、肝脏昼夜节律破坏和产蛋节律紊乱；CLOCK参与调节脂质代谢相关基因，影响脂质合成和分解；肝脏昼夜节律紊乱可能是FLS发生的关键机制之一，钟基因可作为防治潜在靶点。

关键技术方法：样本队列为罗曼粉蛋鸡，共200只，120日龄，饲养于四川农业大学雅安校区教学科研园区家禽养殖场，随机分为对照组（CG）和FLS组各100只；CG饲喂玉米-豆粕基础日粮，FLS组饲喂高脂日粮，16 h光照/8 h黑暗，7:00—23:00光照。290日龄在六个昼夜时间点（7:00、11:00、15:00、19:00、23:00、3:00）采样，每点4只。主要方法包括血清生化与激素ELISA、肝脏油红O染色、六个时间点时序肝脏RNA-seq及差异表达/KEGG/GSEA/GSVA分析、MetaCycle和circacompare节律性分析、Series Test of Cluster、Mfuzz、加权基因共表达网络分析（WGCNA）和蛋白互作分析；原代鸡肝细胞分离、CLOCK过表达、油酸（OA）诱导脂肪变性、CCK-8、油红O和qRT-PCR（2^-ΔΔCt）。

研究结果：
高脂饮食诱导蛋鸡肝脏脂质代谢异常：通过大体形态、肝重、油红O染色、血清生化和炎症基因qRT-PCR，研究人员发现FLS组肝脏增大、黄色且脆弱，肝重显著升高，肝细胞大量脂滴，血清TC、TG、ALT、AST升高，肝脏TNF-α、IL-1β、IL-6表达增加而IL-10降低，提示成功建立FLS模型。
高脂饮食破坏罗曼粉蛋鸡产蛋性能和生殖节律：产蛋率监测显示FLS组早期短暂升高后持续降低；30天产蛋时间分析显示FLS产蛋分散、峰值延迟30 min，7:00—12:00产蛋比例由72.98%降至56.85%；个体产蛋曲线显示FLS节律不稳定、逐渐延迟甚至停产。ELISA和节律分析显示E2、FSH、IGF1等在两组呈24 h节律，FLS中PROG在ZT0、IGF-1在ZT4显著升高，LH无显著节律，提示高脂饮食改变生殖激素时间模式。
脂肪肝综合征破坏肝脏转录谱和脂质代谢通路：六个时间点RNA-seq显示测序质量高，保留13,856个基因；各时间点差异表达基因数不同，KEGG富集于脂肪酸代谢、脂肪酸生物合成、脂肪酸降解和甘油磷脂代谢，部分富集昼夜节律通路；GSVA和GSEA显示脂肪酸生物合成上调，脂肪酸降解、甘油磷脂代谢和醚脂代谢下调；qRT-PCR验证10个基因与RNA-seq一致，提示脂质代谢和昼夜调控通路广泛失调。
Series test of cluster分析和WGCNA鉴定FLS改变的昼夜基因和通路：Series Test of Cluster将基因分为15簇，昼夜相关基因在CG主要位于簇5和15，在FLS主要位于簇3和6；WGCNA得到7个模块，turquoise和red模块富集昼夜节律、昼夜节律同步化和昼夜节律-fly通路，CG中turquoise模块与ZT0显著负相关、red模块与ZT0显著正相关，而FLS中这些相关消失，提示高脂饮食改变肝脏基因节律表达。
脂肪肝综合征破坏昼夜基因的节律表达：MetaCycle发现CG有1,046个节律表达基因，FLS仅81个；1,025个基因失去节律，60个新获得节律；核心钟基因CLOCK（P<0.01）、CRY2（P<0.05）和BHLHE40（P<0.05）在FLS失去节律表达，CLOCK在对照组具有最强统计证据和典型24 h节律，因此被选为后续靶基因。
CLOCK过表达改变肝细胞脂质代谢和昼夜基因表达：原代鸡肝细胞经细胞角蛋白18（CK18）免疫荧光确认，p-CLOCK显著增加CLOCK mRNA；油红O显示CLOCK过表达减少脂质积累，细胞内TC和TG降低，FASN、SCD、SREBF1、SREBF2表达降低而PPARα升高；ARNTL升高，BHLHE40和CRY2降低，NAMPT和SIRT1升高，提示CLOCK调控肝细胞脂质代谢和昼夜基因。
CLOCK缓解OA诱导的原代鸡肝细胞脂质代谢功能障碍：600 μM OA诱导脂质积累、TC和TG升高，上调SREBF1、ACACA、FASN、SCD、SREBF2、VLDLR和APOB，增加TNF-α并降低IL-10；CLOCK过表达后脂质积累减少，TC和TG降低，脂生成基因下调，TNF-α降低而IL-10升高，NAMPT和SIRT1上调，提示CLOCK通过抑制脂生成和炎症缓解OA诱导的脂质代谢功能障碍。研究也指出600 μM OA伴随细胞活力下降，不能完全排除细胞应激影响。

讨论部分：研究人员认为FLS并非单纯肝脂储存异常，而是影响肝脏功能和生殖输出的更广泛代谢与时间扰动。禽肝是de novo lipogenesis和卵黄前体产生中心，肝代谢稳态破坏可直接影响卵泡发育、排卵时间和产蛋节律。FLS伴随肝脏昼夜组织显著破坏，时序转录组显示脂质代谢和昼夜通路广泛重塑；脂肪酸生物合成增加而脂肪酸降解、甘油磷脂和醚脂代谢降低，与严重肝脂沉积一致。节律性分析显示FLS肝脏节律基因数量显著减少，关键节律转录本振幅、相位和中值改变，提示昼夜协调崩塌。昼夜系统不仅伴随代谢，还时间组织代谢；时间结构破坏可使脂质合成、氧化、运输和内分泌信号失同步，放大代谢失衡。产蛋延迟和分散及生殖激素节律改变支持FLS影响肝脏代谢和生殖时间协调。整合分析一致将CLOCK置于核心调控网络。CLOCK与BMAL1形成异二聚体，通过E-box激活PER和CRY，PER/CRY反馈抑制CLOCK/BMAL1，维持核心转录-翻译反馈环；CLOCK/BMAL1还与其他顺式调控元件和转录调节因子互作协调代谢通路节律。哺乳动物中CLOCK功能障碍促进肥胖、血脂异常和肝脂肪变性，本研究支持禽肝细胞中类似作用。功能验证表明CLOCK过表达减少脂滴、TC/TG和脂生成基因，增加PPARα，使系统从脂质合成转向更氧化状态；OA模型中还降低促炎基因并增加IL-10。NAMPT/SIRT1轴可能提供CLOCK与肝脂稳态的机制联系：CLOCK可调节NAMPT，影响细胞内NAD⁺可利用性和SIRT1活性，SIRT1通过去乙酰化调节代谢基因，抑制肝脂合成和积累；本研究中CLOCK过表达增加NAMPT和SIRT1，同时降低SREBF1等脂生成基因，支持昼夜-代谢耦合模型。研究结论翻译：总之，研究人员发现高脂饮食导致脂肪肝综合征，造成蛋鸡肝脏异常脂质沉积和昼夜节律破坏。重要的是，钟基因CLOCK参与调节脂质代谢相关基因，从而影响脂质合成和分解，提示肝脏昼夜节律紊乱可能是脂肪肝综合征发生的关键机制之一。未来研究可考虑将钟基因作为蛋鸡脂肪肝综合征预防和控制的潜在靶点，为脂肪肝相关代谢紊乱的昼夜干预提供新见解。