《Small Science》：Particle Size Measurement of Organic Nanocarriers: A Case Study Using Polyacrylate-Based Polymer Nanocarriers
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论文摘要翻译
本研究评估了粒径测量技术对水合状态下聚丙烯酸酯基聚合物纳米载体（PNCs）的灵敏度、检测限及适用性。研究人员将动态光散射（DLS）、粒子追踪分析（PTA）、冷冻透射电镜（cryo-TEM）、扫描电镜（SEM）和差速离心沉降（DCS）应用于商业级和
论文摘要翻译
本研究评估了粒径测量技术对水合状态下聚丙烯酸酯基聚合物纳米载体（PNCs）的灵敏度、检测限及适用性。研究人员将动态光散射（DLS）、粒子追踪分析（PTA）、冷冻透射电镜（cryo-TEM）、扫描电镜（SEM）和差速离心沉降（DCS）应用于商业级和实验室规模的PNCs，以评估紫外介导交联的影响，以及活性物质（ASs）和商业分散剂对粒径分布的影响。多分散性和低折射率使得DLS结果不可靠。PTA无法检测小于50 nm的PNCs，且需要针对每种PNC调整浓度，给比较带来挑战。DCS能够捕捉多分散性，但同样无法检测小于50 nm的PNCs。值得注意的是，DLS、PTA和DCS均假设球形几何结构，而商业PNCs不太可能呈球形，因此严重挑战了数据解读。cryo-TEM能够检测小于50 nm的PNCs，并提供最可靠的粒径分布。所测PNCs之间的巨大差异警示在开展风险评估时不应使用模型PNCs和进行交叉推断。本研究结果证实了现有方法存在的挑战和不足，并呼吁开展更多研究以开发适用于PNCs的多方法策略，以及调整经济合作与发展组织（OECD）指南以表征日益广泛应用于各行业的PNCs。
论文解读
一、研究背景与问题
根据欧洲食品安全局（EFSA）的定义，纳米材料是指含有粒径分布范围在1–100 nm内占50%或以上颗粒的材料。聚合物纳米载体（PNCs）作为一类粒径范围在1–1000 nm的软质纳米颗粒，被广泛用于递送维生素、药物和农用化学品等活性物质（ASs）。粒径分布和多分散性（PDI）是决定PNC悬浮液均匀性、功效、体内外行为及长期储存期间理化稳定性的关键参数，直接影响颗粒与生物系统的相互作用，如细胞摄取、生物分布和排泄等。在纳米医学领域，粒径大小决定了颗粒在体内的清除途径和组织滞留行为，因此准确测定PNCs的粒径分布对于风险评估至关重要。
然而，现有的粒径表征方法主要针对无机纳米材料开发。无机纳米材料具有独特的元素组成、晶体结构、结构刚性、高折射率和质量对比度，相对容易从背景介质中区分。而完全由软质碳基聚合物组成的有机纳米材料折射率低、质量对比度低、光散射特性弱，这使得PNCs未被纳入OECD 125测试指南的范围，也没有针对PNCs粒径表征的具体建议。此外，不同分析技术基于不同的测量原理（如数量基或强度基），导致即使对于相对简单的聚苯乙烯标准PNCs，测量结果也存在差异。商业PNC悬浮液含有活性物质和专有分散剂，比标准PNCs更为复杂，但不同粒径技术对复杂商业PNCs的适用性尚未得到系统测试和批判性评估。本研究正是为了填补这一空白，推动PNCs的发展和监管评估。
二、研究内容与意义
研究人员选取了一系列丙烯酸基PNCs作为案例研究对象，这些PNCs因其亲水性和pH响应特性而被广泛应用于农业、制药和食品领域的活性物质递送。研究涉及五种PNCs：商业规模交联（CL）、非交联（NCL）、负载活性物质的交联（CL-AS）和非交联（NCL-AS）PNCs，以及实验室规模内部合成的PNCs。研究采用冷冻透射电镜（cryo-TEM）、动态光散射（DLS）、粒子追踪分析（PTA）和差速离心沉降（DCS）四种技术，在PNCs的水合状态下进行粒径表征，主要目标是评估各技术的灵敏度、检测限和适用性，并解释商业产品与四种PNC模型之间的差异。所有表征和数据分析尽可能遵循OECD 125指南。
三、主要关键技术方法
本研究采用了四种互补的粒径表征技术：冷冻透射电镜（cryo-TEM）在冷冻水合状态下直接成像PNCs，使用Tecnai FEG20透射电镜，在200 kV电子束能量下成像，通过ImageJ软件手动计数非重叠、清晰可辨的颗粒（多分散悬浮液≥700个颗粒）并基于对数正态分布模型报告粒径分布；动态光散射（DLS）使用Malvern Zetasizer Nano仪器，在173°背散射角下测量颗粒的平移扩散系数，通过斯托克斯-爱因斯坦方程转换为流体动力学直径；粒子追踪分析（PTA）使用Zetaview仪器配备488 nm激光，通过视频追踪单个PNCs的布朗运动来确定平移扩散系数；差速离心沉降（DCS）使用CPS 24 000-disc离心机，在24 000 rpm转速下，通过蔗糖密度梯度分离不同粒径的颗粒，基于沉降速度计算粒径。商业PNCs来自Vive Crop Protection Inc.（加拿大多伦多），实验室规模PNCs按照该公司专利方法内部合成。
四、研究结果
4.1 Cryo-TEM分析
cryo-TEM成像显示，交联产生了比非交联版本更小、更紧凑的CL PNCs。内部合成的PNCs比商业规模PNCs更小（约50 nm），表明实验室规模模型可能不适合作为商业产品监管风险评估的替代品。商业PNCs中观察到囊泡样形态，而实验室规模PNCs未出现此形态，这可能与商业配方中未公开的助剂有关。由于活性物质诱导的团聚，AS负载PNCs的成像具有挑战性，呈现暗色非球形颗粒，使得OECD标准中仅考虑非重叠、边界清晰颗粒的计数标准不适用于AS负载PNCs，因此无法用此技术确定其粒径。
4.2 DLS分析
DLS测量显示所有五种PNCs的平均流体动力学粒径均大于300 nm，与cryo-TEM测量的约100 nm（内部合成约50 nm）结果严重不一致。这种差异并非源于水化层，而是由于多分散和非球形PNCs的存在。所有PNCs的平均多分散性（PDI）在0.5–0.8之间，证实了悬浮液的宽粒径分布。DLS未达到OECD可重复性标准。由于瑞利散射中散射强度与粒径的6次方成正比，少量大颗粒或团聚体的散射主导了测量数据。DLS不适用于多分散悬浮液和非球形颗粒，对于AS负载PNCs的测量结果具有误导性。
4.3 PTA分析
PTA达到了OECD 125指南的重复性标准，未观察到商业分散剂的显著影响。然而，AS负载PNCs需要稀释至极低浓度（1 mg/L）才能实现单个颗粒追踪，与空载PNCs（10–35 mg/L）的浓度不同，挑战了比较的有效性。预采集灵敏度参数对粒径测定有显著影响：在灵敏度80和60下，CL-AS的粒径分别为123±2 nm和185±13 nm。降低灵敏度会导致约一半100 nm小颗粒无法被检测。PTA无法检测小于50 nm的内部合成小PNCs，因为其低折射率导致光散射弱。PTA虽然通常推荐用于多分散纳米材料，但并未很好地适应本研究的PNCs。
4.4 DCS分析
DCS能够检测NCL PNCs和AS负载PNCs中存在的大颗粒或团聚体，并将其作为独立亚群识别。AS负载PNCs中的显著团聚被DCS清晰识别。DCS在单次运行中分析数百万颗粒，产生统计稳健的数据，且不受预采集参数影响。然而，DCS的最大转速（24 000 rpm）将PNCs的检测限限制在50 nm，更小的颗粒需要过长的沉降时间而无法维持稳定的蔗糖梯度。DCS能够区分纳米级空载和负载PNCs与其对应的非纳米版本。商业分散剂对粒径无显著影响。
4.5 技术间比较
cryo-TEM获得的数值显著小于PTA和DCS获得的数值（p<0.0001），这是因为cryo-TEM基于数量分布，低估了大颗粒的贡献。DLS和PTA测量的是强度基平均流体动力学直径，包含水化层。对于最小PNCs（内部合成），数量分布转换为体积分布后的差异尤为显著，确认了PTA和DCS因低折射率和低密度而无法检测小PNCs。DLS、PTA和DCS均假设球形几何结构，但AS负载PNCs偏离球形，因此需要显微镜验证。
4.6 PNCs间比较
实验室规模与商业规模交联PNCs之间存在差异，这归因于合成条件（搅拌、混合、紫外暴露）和设备及化学试剂等级的差异。负载ASs显著影响PNCs的粒径和形状。DCS显示CL和NCL与CL-AS和NCL-AS显著不同，表明空载PNCs不能代表AS负载PNCs。
五、结论与建议
研究人员建议：PNCs表征应在水合状态下进行，因为软PNCs的粒径、团聚和表面特性在干态和湿态间差异显著；PTA粒径分布应连同预采集参数（如灵敏度）一起报告，对于多分散PNCs建议至少使用两种灵敏度条件进行表征；DLS、PTA和DCS的球形几何假设需要通过显微镜验证；cryo-TEM对小于50 nm和大于200 nm的PNCs粒径分布应谨慎解读；应使用最终商业PNC悬浮液进行风险评估，而不是使用模型PNCs。研究结论强调，考虑到可靠的粒径表征对风险评估的重要性，显然需要更多研究来支持适用于PNCs的多方法策略的开发，以及制定或调整OECD指南以适应食品、农业和制药行业使用的多样化PNCs。
