《Theriogenology》：Embryo-derived extracellular vesicle miRNA cargo reflects developmental competence in porcine
in vitro-produced embryos
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摘要细胞外囊泡（EVs）已成为胚胎发育期间细胞间通信的重要介质，并且代表了胚胎发育能力非侵入性生物标志物的一个有前景的来源。本研究首次表征了猪体外生产胚胎释放的EVs，并比较了源自囊胚（BL）和非囊胚（N-BL）的EVs中的微RNA（miRNA）货物，以鉴定与发育能力相关的分
摘要
细胞外囊泡（EVs）已成为胚胎发育期间细胞间通信的重要介质，并且代表了胚胎发育能力非侵入性生物标志物的一个有前景的来源。本研究首次表征了猪体外生产胚胎释放的EVs，并比较了源自囊胚（BL）和非囊胚（N-BL）的EVs中的微RNA（miRNA）货物，以鉴定与发育能力相关的分子特征。通过标准的体外成熟、受精和培养程序生产猪胚胎。在体外培养第7天，将胚胎分为BL和N-BL组，洗涤并以每组50个培养6小时。条件培养基经尺寸排阻层析进行EV分离，并通过动态光散射、透射电子显微镜和流式细胞术进行表征。提取总RNA并进行小RNA测序。各组之间未检测到EV浓度或平均粒径的显著差异。共鉴定出123个miRNA，包括105个共享miRNA、15个BL特异性miRNA和3个N-BL特异性miRNA。在共享miRNA中，ssc-miR-148a、ssc-miR-99a、ssc-miR-122和ssc-miR-151a在BL来源的EVs中上调，而ssc-miR-181b下调。功能富集分析揭示了与BL来源EVs相关的发育信号传导、细胞组织和囊泡转运等生物学过程，而N-BL来源的EVs与细胞凋亡、细胞因子介导的信号传导、发育停滞和表观遗传调控相关。综上所述，这些发现表明胚胎来源EVs的miRNA货物反映了胚胎发育能力，并鉴定出与EV相关的miRNA作为猪体外生产系统中早期胚胎发育的有前景的非侵入性生物标志物和候选调节因子。
引言
体外胚胎生产（IVP）已成为猪生殖生物技术中的一项有价值工具，在动物生产、遗传改良和生物医学研究中具有重要应用[1]。然而，尽管过去几十年取得了相当大的进展，与体内胚胎发育相比，猪IVP的效率仍然不理想[2]。与体内胚胎相比，体外条件下生产的胚胎通常表现出发育能力下降和胚胎质量受损[3]。IVP胚胎发育能力下降是由多种因素造成的，包括卵母细胞胞质成熟不完全[4]、多精受精发生率高[5]，以及重要的是，未能完全复制雌性生殖道动态物理化学和分子环境的次优培养条件[6]。
因此，鉴定与胚胎发育能力相关的分子决定因子仍然是改进当前IVP系统和开发更可靠的胚胎评估策略的主要挑战。在生理条件下，胚胎暴露于高度动态的母体环境中，胚胎与生殖道之间持续的双向通信对于发育成功至关重要[7]。这种相互作用涉及蛋白质、脂质和核酸的交换，调控细胞增殖、谱系决定和代谢适应等关键过程[8]、[9]。相比之下，体外生产的胚胎在简化的培养系统中发育，这些系统无法完全复制母体生殖道内存在的复杂信号网络，可能损害其发育能力[10]。除了胚胎-母体通信外，植入前胚胎还能通过旁分泌信号机制相互通信，这些机制与群体培养系统中改善的发育结果相关，包括更高的发育率和囊胚产量[11]、[12]。总之，这些观察结果表明，胚胎主动释放信号分子，不仅参与发育过程，还可能反映其生理状态和发育潜能。
在参与胚胎细胞间通信的因素中，细胞外囊泡（EVs）已成为早期胚胎发育期间细胞信号传导的重要介质[13]。EVs是由大多数细胞类型分泌的膜结合纳米颗粒，包括生殖道细胞和植入前胚胎，运输多种生物活性分子，如蛋白质、脂质和核酸[14]。通过将分子货物转移至受体细胞，EVs参与多种生殖过程，包括卵母细胞成熟、受精、胚胎发育和植入[15]。越来越多的证据表明，EVs构成了胚胎分泌组的重要组成部分，并在介导生殖环境内的通信中发挥关键作用。因此，胚胎来源的EVs代表了宝贵的生物学信息来源，可能为成功的胚胎发育背后的分子机制提供见解[16]、[17]。
在EVs运输的分子货物中，微RNA（miRNAs）因其转录后基因调控的关键作用而受到极大关注[18]。这些小非编码RNA在植入前胚胎发育和发育能力获得过程中发挥基本作用[19]。重要的是，封装在EVs内的miRNA受到保护免受降解，并能转移至受体细胞，在那里可以调节基因表达和细胞功能[20]。它们卓越的稳定性和条件特异性表达谱使与EV相关的miRNA成为胚胎发育能力非侵入性生物标志物特别有吸引力的候选分子和改进取舍生殖技术的有前景靶标[21]。
在几种哺乳动物中，已在胚胎培养基中鉴定出胚胎来源的EVs，并显示其含有与胚胎存活能力和发育潜能相关的分子特征[22]、[23]。然而，猪植入前胚胎是否主动释放EVs以及其分子货物是否反映胚胎发育能力仍完全未知。鉴于在动物和人类辅助生殖中开发客观和非侵入性胚胎评估方法的兴趣日益增加，表征胚胎来源EVs中与发育能力相关的分子特征可能为提高胚胎选择策略和优化IVP系统提供新机会。
因此，本研究的目的是首次表征猪体外生产胚胎释放的细胞外囊泡，并确定胚胎来源EVs的miRNA货物是否根据胚胎发育能力不同而存在差异。
各章节摘要
实验设计
卵丘-卵母细胞复合物在五个独立生物学重复中进行了体外成熟（IVM）、受精（IVF）和培养（IVC）。在IVC第7天通过形态学评估胚胎发育能力。达到囊胚阶段的胚胎被归类为囊胚（BL），而所有未能发育到囊胚阶段的胚胎，包括发育停滞和退化的胚胎，被归类为非囊胚（N-BL）。
IVP效率
通过评估卵母细胞成熟、受精、囊胚形成和总胚胎生产率来评估体外胚胎生产系统的效率。卵母细胞成熟率为91.93 ± 1.85%，而受精、卵裂和囊胚形成率分别为31.24 ± 5.18%、68.76 ± 6.52%和55.67 ± 3.79%。总胚胎生产效率为36.39 ± 4.35%。不同发育阶段胚胎的代表性图像见图2。
讨论
本研究首次表征了猪植入前胚胎释放的EVs，并证明其miRNA货物根据胚胎发育能力不同而存在差异。鉴于猪作为家畜物种和宝贵生物医学模型的双重重要性，这些发现为与成功植入前胚胎发育相关的分子机制提供了新的见解，并突出了胚胎来源EVs作为非侵入性
结论
总之，我们的发现首次表征了猪体外生产胚胎释放的EVs，并揭示了在IVC第7天被归类为BL和N-BL的胚胎之间不同的EV相关miRNA谱。这些结果确定了与胚胎发育状态相关的候选分子特征，并为前瞻性早期和功能研究提供了基础。在发育结局之前收集的独立样本中进行验证将是必要的，以确定
CRediT作者贡献声明
朱佳桥：写作 – 审阅与编辑，方法论。Cristina A Martinez-Serrano：写作 – 审阅与编辑，资源，项目管理，方法论，资金获取。李军伟：写作 – 审阅与编辑，方法论。谭安开：写作 – 审阅与编辑，软件。Carolina G Cabrera-Gomez：写作 – 审阅与编辑，方法论。Paula Blanco-Cueto：写作 – 审阅与编辑，方法论。David Gascon-Collado：写作 – 初稿，软件，方法论
数据可用性
本研究产生的小RNA测序数据已存入NCBI序列读取档案（SRA），BioProject登录号为PRJNA1498623。
利益冲突声明
作者声明不存在可能被视为损害所报告研究的公正性的利益冲突。
资助
本研究由MICIU/AEI/10.13039/501100011033、ERDF/EU（项目编号 PID2023-150622OA-I00）和中国交流计划（JC202606070G）支持。C.A.M.-S.由Ramón y Cajal合同（RYC2022-036771-I）支持，由MICIU/AEI/10.13039/501100011033资助。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有任何已知的竞争经济利益或个人关系，这些可能影响本文所报告的工作。
致谢
作者感谢当地屠宰场（Comarán S.L.，西班牙马德里）的工作人员提供的帮助以及为本研究提供的副产卵巢。
David Gascon-Collado | Paula Blanco-Cueto | Carolina G. Cabrera-Gómez | Ankai Tan | 朱佳桥 | 李军伟 | Cristina A. Martinez-Serrano
