支持细胞中AMH信号的变化与短光周期诱导的睾丸萎缩相关

《Theriogenology》：Altered AMH Signaling in Sertoli Cells Is Associated with Short Photoperiod-Induced Testicular Regression in Siberian Hamsters

摘要

季节性睾丸萎缩是季节性繁殖哺乳动物中一种关键的适应性生理过程，然而目前已知的睾丸萎缩状态建立后与之相关的抗苗勒管激素（AMH）信号变化仍不充分。在本研究中，我们将性成熟的叙利亚仓鼠分别置于长光期、中光期和短光期条件下饲养8周，以表征短光期诱导的睾丸萎缩状态建立后与AMH相关的变化。我们对睾丸形态、AMH/AMHR2-SMAD信号通路以及凋亡相关参数进行了检测。此外，我们从正常生理条件下的性成熟仓鼠中分离原代支持细胞，进行AMH过表达实验，以评估细胞对AMH表达增加的反应。短光期组表现出睾丸大小、生精上皮厚度和管径减小，同时AMH和AMHR2相关信号以及凋亡相关标志物增加。在正常原代支持细胞中，AMH过表达增强了AMH/AMHR2-SMAD相关信号通路，并伴随凋亡相关因子的表达增加。这些结果表明，在短光期诱导的睾丸萎缩建立状态下，AMH的合成和AMHR2相关信号发生了改变。体外实验结果进一步提示，AMH表达增加可促进支持细胞出现凋亡相关表型。然而，这些结果并不能证明AMH在体内启动或直接驱动睾丸萎缩。相反，这些结果支持了AMH信号改变在萎缩状态下支持细胞功能调节中可能发挥作用的观点。

引言

季节性是地球环境的基本特征，由地球自转轴的倾斜和公转轨道所决定[1]。这导致了环境因素的周期性变化，促使哺乳动物演化出多种繁殖策略，以确保后代的最大存活率[2]、[3]。季节性繁殖是其中一项关键策略[4]。然而，传统的动物繁殖研究主要集中在繁殖季节，对非繁殖期的关注相对较少[5]、[6]。

尽管季节性睾丸萎缩在季节性繁殖动物中被广泛观察到，但睾丸萎缩的程度、持续时间和特征因物种不同而异，取决于其繁殖策略和内分泌调节模式。尽管存在这些种间差异，但精子发生的季节性调节代表了保守的适应性机制，使动物能够将繁殖活动与有利的环境条件同步。精子发生的季节性变化是季节性繁殖动物的特征性适应，其生理节律与繁殖周期紧密一致[7]。在繁殖季节，睾丸内的生精细胞不断增殖、分化并完成精子发生，从而促进睾丸组织的发育和增大[7]、[8]、[9]、[10]、[11]。在季节性繁殖动物中，光周期等环境线索的变化可以抑制繁殖活动，并常与非繁殖期的睾丸萎缩相关[12]。然而，睾丸萎缩过程中的细胞事件和生殖细胞丢失的时间在物种间差异很大。季节性繁殖仓鼠的研究报道，在光期诱导的睾丸萎缩过程中，生殖细胞的增殖减少，生精细胞和支持细胞的凋亡增加[11]、[13]。除了精子细胞外，凋亡也可能发生在精原细胞和精母细胞中，尽管细胞丢失的程度和时间在不同物种和萎缩阶段之间可能存在差异[11]、[14]。在仓鼠中，睾丸萎缩期间已报道了凋亡信号通路的改变，包括FAS/FASL相关通路以及Bcl-2等凋亡相关蛋白的变化[11]、[15]。这些发现表明，凋亡参与了光期诱导萎缩过程中睾丸组织的重塑，但涉及的特定细胞群体和潜在的凋亡通路并不必然在所有季节性繁殖物种中保守。因此，睾丸萎缩的细胞特征应以物种和阶段相关的方式进行解读。总体而言，季节性睾丸萎缩代表了对繁殖活动的适应性抑制，在不利环境条件下减少繁殖投入，当有利环境条件恢复时可随之恢复生殖功能。

生精细胞的增殖、分化和凋亡不仅受内在机制调节，还受体细胞微环境的外部调控[16]、[17]。支持细胞作为微环境的关键调节者，对精子发生的正常进行至关重要[18]、[19]。这些细胞形成紧密连接，构成血睾屏障（BTB），将生精上皮分为基底部和管腔部两个区室。精原细胞和早期精母细胞位于基底部区室，而晚期生殖细胞，如粗线期精母细胞和精子细胞，位于管腔部区室[20]、[21]、[22]。这种空间分离使晚期生殖细胞与免疫系统隔离，维持了曲细精管的稳态，并为生殖细胞的发育提供了必要的环境[23]。既往研究表明，在非繁殖期，季节性繁殖动物的支持细胞数量减少，支持细胞分泌的调节因子可能通过影响生殖细胞的存活、增殖和分化而促进精子发生的抑制。例如，在叙利亚仓鼠（Phodopus sungorus）睾丸萎缩期间，不同发育阶段的支持细胞和生殖细胞数量均明显减少，提示支持细胞功能的改变可能是季节性睾丸萎缩的底层关键调节机制[11]、[13]。

抗苗勒管激素（AMH）主要由睾丸支持细胞合成和分泌，是参与调节支持细胞功能和维持生殖微环境的重要因素[24]、[25]。既往研究表明，AMH对支持细胞具有双重调节作用，既能促进其增殖，也能诱导其凋亡，且这些效应表现出明显的浓度依赖性[26]。AMH属于转化生长因子-β（TGF-β）超家族，具有进化保守性，在细胞增殖、分化和凋亡中发挥作用[27]、[28]。AMH前体经翻译后加工形成活性二聚体，与II型受体AMHR2结合。该结合诱导AMHR2磷酸化，激活I型受体，进一步磷酸化Smad蛋白，触发Smad1/5/9通路。该通路调节下游基因表达并启动线粒体凋亡，从而调控支持细胞的命运[29]、[30]、[31]、[32]、[33]。

AMH是支持细胞表达和分泌的关键激素，其表达受内分泌信号和局部睾丸微环境的调控[24]、[34]。在正常生理条件下和睾丸发育过程中，AMH的表达和分泌与支持细胞功能的内分泌调节密切相关。FSH促进支持细胞增殖并刺激AMH的合成和分泌，而睾酮则抑制AMH表达，与支持细胞的成熟进程相关[35]、[36]、[37]、[38]、[39]。这些发现表明，AMH与睾丸功能在生理和发育条件下的激素调节密切相关。重要的是，在季节性繁殖动物的光期诱导睾丸萎缩期间，内分泌环境会发生显著变化。既往研究报告了睾丸萎缩及其后续再生过程中循环中FSH、LH、睾酮和抑制素相关激素的改变[40]。尽管这些研究并未直接检测AMH，但鉴于这些内分泌因子与AMH在正常生理和发育条件下已建立的关联，提出了一个重要问题：在季节性睾丸萎缩期间内分泌环境改变时，AMH是否也会发生改变。鉴于内分泌激素与AMH在睾丸发育和生理稳态中已确立的调节关系，合理推测AMH的表达和信号通路也可能对季节性睾丸萎缩期间发生的剧烈内分泌重塑作出反应。然而，当前关于AMH信号与季节性睾丸萎缩之间功能联系的知识仍然有限。现有的大多数AMH研究主要集中在人类生殖障碍和胚胎性别分化方面，而AMH在调节季节性繁殖动物非繁殖期睾丸萎缩中的潜在作用仍知之甚少[41]、[42]。

叙利亚仓鼠（Phodopus sungorus）是研究光期依赖性睾丸功能调节的理想模型，它是一种典型的长日型繁殖动物，其繁殖活动受长光期刺激，受短光期抑制。本研究旨在表征短光期诱导的睾丸萎缩建立后与AMH相关的变化。因此，在本研究中，我们在不同光期条件下检测了睾丸中AMH的表达、AMH/AMHR2信号通路以及线粒体凋亡相关基因。我们进一步通过支持细胞中的体外AMH过表达模型验证了AMH的功能作用。我们的结果表明，在这种长日型繁殖动物模型中，短光期暴露显著增加了支持细胞中AMH的表达，激活了AMH/AMHR2信号通路，并诱导支持细胞发生线粒体依赖的凋亡，导致曲细精管完整性受损和精子发生活动降低。这些发现提示，AMH可能通过调节支持细胞凋亡，成为非繁殖期光期诱导睾丸萎缩中参与的重要调节因子，为季节性繁殖抑制的内分泌调节提供了新的见解。

片段说明

动物伦理声明

所有动物实验均按照《实验动物福利和伦理审查指南》（GB/T 35892-2018）进行，并经曲阜师范大学生物医学伦理委员会批准（批准号：202521147）。本研究严格遵守ARRIVE 2.0指南。

光期动物模型的确立

本研究所用的雄性叙利亚仓鼠采集自中国内蒙古锡林浩特。仓鼠的大致年龄和生殖发育状态根据以下因素确定。

不同光期下体重、睾丸重量和睾丸指数的差异

对叙利亚仓鼠的生理参数进行了评估，以确认光期动物模型的成功建立。统计分析显示，不同光期处理下体重、睾丸重量和睾丸指数存在显著差异。光期处理前，三组实验动物间的体重无显著差异。处理后，SD组的体重显著低于LD组（

讨论

本研究考察了AMH信号与短光期诱导的叙利亚仓鼠睾丸萎缩之间的关系。经过8周的短光期暴露，睾丸大小、睾丸指数、生精上皮厚度和管径均减小，而睾丸中AMH/AMHR2-SMAD信号和凋亡相关标志物则增加。在原代支持细胞中，AMH过表达增强了相同信号通路并促进了凋亡相关的分子CRediT作者贡献声明

Chao Fan（范超）：可视化。Jinhui Xu（许金辉）：可视化，项目管理。Huiliang Xue（薛慧良）：项目管理。Laixiang Xu（徐来祥）：项目管理，经费获取。Lei Chen（陈磊）：可视化。Hengyu Zhang（张恒宇）：论文写作—审阅与编辑，论文写作—初稿撰写，软件，调查研究。Xinran Wang（王欣然）：论文写作—审阅与编辑，论文写作—初稿撰写，软件，方法学，调查研究，概念构思。Ming Wu（吴明）：论文写作—审阅与编辑，论文写作—初稿撰写，验证。

知情同意声明

不适用。

利益冲突

作者声明不存在竞争利益。

机构审查委员会声明

不适用。

数据可用性声明

数据可根据请求提供。

资金支持

本研究受国家自然科学基金（编号：32571777和31800308）资助。

利益冲突声明

作者声明，不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

作者已审阅和编辑本稿件输出内容，并对本出版物的内容承担全部责任。

Ming WU | Xinran Wang | Hengyu ZHANG | Huiliang XUE | Jinhui XU | Chao Fan | Lei CHEN | Laixiang XU