《Antioxidants》：Metabolomic and Transcriptomic Changes in Porcine Cumulus–Oocyte Complexes Following Vitrification: Cysteinyl-Glycine as an Antioxidant Enhances the Quality of Vitrified Oocytes
编辑推荐：
玻璃化（vitrification）是保存猪生发泡（germinal vesicle, GV）期卵母细胞的有效方法，但冷冻诱导损伤仍是后续胚胎发育的主要限制。尽管既往研究已探讨玻璃化后卵母细胞与卵丘细胞（cumulus cells, CCs）的转录组和蛋白质组
玻璃化（vitrification）是保存猪生发泡（germinal vesicle, GV）期卵母细胞的有效方法，但冷冻诱导损伤仍是后续胚胎发育的主要限制。尽管既往研究已探讨玻璃化后卵母细胞与卵丘细胞（cumulus cells, CCs）的转录组和蛋白质组变化，但低温损伤相关的代谢改变仍知之甚少。在本研究中，研究人员对体外成熟（in vitro maturation, IVM）后玻璃化卵母细胞及CCs进行代谢组学分析，以鉴定关键差异代谢物。随后通过在卵母细胞成熟过程中补充候选代谢物进行功能验证。在玻璃化卵母细胞中，19种代谢物显著上调，44种显著下调。整合代谢组学与转录组学分析显示，显著改变的代谢物与基因汇聚于能量代谢、谷胱甘肽（glutathione）代谢和甘油磷脂（glycerophospholipid）代谢等生物学通路。在源自玻璃化卵母细胞的CCs中，70种代谢物显著上调，21种显著下调。整合分析显示，显著改变的代谢物与基因汇聚于谷胱甘肽代谢和甘油磷脂代谢等通路。值得注意的是，卵母细胞与CCs共享28种差异表达代谢物，其中半胱氨酰甘氨酸（cysteinyl-glycine, Cys-Gly）在玻璃化后卵母细胞和CCs中均显著降低。在IVM中补充Cys-Gly可改善玻璃化卵母细胞质量，表现为氧化应激降低、过度凋亡和异常自噬受到抑制、胚胎发育增强以及卵丘扩展增加。总之，这些发现提供了猪GV卵母细胞和CCs玻璃化后的全面代谢图谱，为卵母细胞低温损伤机制提供了新见解。靶向关键代谢通路或补充特定代谢物，如Cys-Gly，可能是提高玻璃化猪卵母细胞活力的有前景策略。
猪卵母细胞脂质含量高、对低温敏感，玻璃化（vitrification，一种超快速冷冻保存技术）虽可保存生发泡（germinal vesicle, GV）期卵母细胞，但冷冻损伤限制其后续胚胎发育。既往多组学研究多集中于转录组和蛋白质组，玻璃化所致代谢改变尚不清楚。卵丘细胞（cumulus cells, CCs）与卵母细胞通过跨带投射和间隙连接形成卵丘-卵母细胞复合体（cumulus–oocyte complexes, COCs），既支持成熟，又作为冷冻保护剂（cryoprotective agents, CPAs）首道屏障缓冲渗透压；但CPA暴露和玻璃化会降低CCs活力、引起DNA损伤并破坏卵母细胞-CCs通讯。因此，研究人员整合非靶向代谢组和转录组，分析猪GV期COCs玻璃化并体外成熟（in vitro maturation, IVM）后卵母细胞与CCs的代谢和基因改变，并验证关键差异代谢物半胱氨酰甘氨酸（cysteinyl-glycine, Cys-Gly）的作用。结论是玻璃化破坏能量代谢、谷胱甘肽（glutathione, GSH）代谢和甘油磷脂（glycerophospholipid）代谢；补充Cys-Gly可改善玻璃化卵母细胞质量与发育潜力，为优化玻璃化提供策略。
关键技术方法：样本取自商业屠宰场青春期杂交Landrace小母猪卵巢，收集3–8 mm窦卵泡COCs，分为新鲜组与玻璃化后IVM组，收集MII卵母细胞和CCs。关键技术包括COCs玻璃化与升温、IVM、UPLC-MS非靶向代谢组学、RNA-seq、代谢组-转录组联合通路分析；荧光探针检测活性氧（reactive oxygen species, ROS）、脂质过氧化（lipid peroxidation, LPO）、一氧化氮（nitric oxide, NO）、GSH及caspase-3、cathepsin B、自噬和溶酶体活性；qRT-PCR和孤雌激活（parthenogenetic activation, PA）评估卵裂与囊胚形成。
研究结果：
3.1 玻璃化与新鲜GV卵母细胞及CCs体外成熟后的差异代谢谱：通过UPLC-MS分析，共鉴定478种代谢物，427种在人类代谢组数据库（Human Metabolome Database, HMDB）中注释为13类。主成分分析（principal component analysis, PCA）显示玻璃化与新鲜组分离，PLS-DA进一步识别差异代谢物。玻璃化卵母细胞（VO）与新鲜卵母细胞（FO）间有63种差异代谢物，玻璃化CCs（VC）与新鲜CCs（FC）间有91种差异代谢物，二者共享28种；共享代谢物主要参与谷胱甘肽代谢、泛酸和CoA生物合成、磷酸戊糖途径及淀粉和蔗糖代谢，提示卵母细胞与CCs间存在代谢耦合。
3.2 玻璃化与新鲜GV卵母细胞差异代谢通路：VO与FO比较中，63种差异代谢物包括19种上调和44种下调。上调代谢物主要富集于碳水化合物代谢与生物合成，包括淀粉和蔗糖代谢、磷酸转移酶系统、碳水化合物消化吸收、半乳糖代谢、戊糖和葡萄糖醛酸互变以及甘油磷脂代谢；下调代谢物主要富集于铁死亡（ferroptosis）、磷酸戊糖途径、甘油磷脂代谢、AMPK信号和谷胱甘肽代谢。
3.3 卵母细胞转录组变化及差异代谢物与基因整合分析：RNA-seq显示VO与FO间有498个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），其中306个上调、192个下调。上调DEGs富集于Hippo信号通路和内质网蛋白加工，下调DEGs富集于代谢通路、铁死亡和脂肪酸代谢。整合分析得到7条显著富集通路，主要涉及碳水化合物代谢和谷胱甘肽代谢；其中Cys-Gly和GSH下调，谷胱甘肽合成酶（glutathione synthase, GSS）下调，ChaC谷胱甘肽特异性γ-谷氨酰环转移酶1（CHAC1）上调。碳水代谢物中D-fructose、D-fructose-6-phosphate、D-ribulose 5-phosphate、xylulose 5-phosphate、myo-inositol、N-acetyl-D-glucosamine 6-phosphate和3′-dephosphocoenzyme A下调，UDP-D-glucuronic acid和D-(+)-pantothenic acid上调；脂质代谢中溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine, LysoPC）和溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidylethanolamine, LysoPE）显著下调。
3.4 源自玻璃化与新鲜GV卵母细胞的CCs差异代谢通路：CCs中鉴定91种差异代谢物，70种上调、21种下调。上调代谢物主要富集于蛋白质消化吸收、氨基酸代谢、甘油磷脂代谢和mTOR信号通路；下调代谢物主要富集于谷胱甘肽代谢、钙信号通路、催产素信号通路、氧化磷酸化和AMPK信号通路。
3.5 CCs转录组变化及差异代谢物与差异基因代谢通路关联分析：VC与FC间有741个DEGs，其中491个上调、250个下调。上调基因富集于54条通路，主要包括代谢通路、谷胱甘肽代谢和环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate, cAMP）信号通路；下调基因富集于10条通路，包括MAPK和Notch信号通路。整合分析得到7条显著富集通路，包括谷胱甘肽代谢和甘油磷脂代谢；GSH和Cys-Gly显著下调。甘油磷脂代谢中除磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine, PC）外，LysoPC、LysoPE、溶血磷脂酰丝氨酸（LysoPS）和溶血磷脂酰肌醇（LysoPI）均上调。
3.6 Cys-Gly对玻璃化GV卵母细胞发育的影响：补充Cys-Gly（2 mM）或GSH（4 mM）后，卵母细胞存活率高于玻璃化组，但核成熟率无显著差异，卵裂率亦无显著差异。孤雌激活后，Vitr + Cys-Gly组囊胚形成率显著高于玻璃化组，而囊胚总细胞数在各组间无显著差异。
3.7 Cys-Gly对玻璃化GV卵母细胞氧化应激的影响：荧光探针检测显示，Vitr + Cys-Gly和Vitr + GSH组ROS、LPO和NO水平显著低于玻璃化组，GSH水平显著升高；氧化应激反应和谷胱甘肽生物合成相关基因mRNA表达显著增加。
3.8 Cys-Gly对玻璃化GV卵母细胞凋亡和自噬的影响：Vitr + Cys-Gly和Vitr + GSH组caspase-3和cathepsin B活性显著低于玻璃化组，自噬和溶酶体活性显著降低，凋亡和自噬相关基因mRNA表达亦显著降低。
3.9 Cys-Gly对卵丘扩展的影响：补充GSH或Cys-Gly可改善CC扩展，卵丘扩展指数（cumulus expansion index, CEI）3级和4级COCs比例显著增加，2级比例显著降低，整体CEI显著升高；卵丘扩展相关基因及氧化应激和谷胱甘肽代谢相关基因表达显著上调。
讨论部分总结：猪卵母细胞脂质储备高且对低温脆弱，玻璃化易引起渗透压冲击和氧化损伤。整合代谢组与转录组显示，玻璃化后卵母细胞发生广泛代谢重编程，主要表现为能量代谢、氧化应激调节和磷脂代谢紊乱。卵母细胞成熟依赖能量，磷酸戊糖途径对胞质成熟和抗氧化尤为重要；玻璃化后F6P、xylulose 5-phosphate和ribulose-5-phosphate等关键中间物降低，cAMP向AMP转化改变，GSH/GSS下调而CHAC1上调，LysoPC/LysoPE降低。CCs中AMP、F6P及膜合成相关磷脂等能量代谢物上调，PI3K-Akt信号激活，可能补偿卵母细胞能量供应并增强抗凋亡能力；CCs谷胱甘肽代谢变化与卵母细胞同步，而甘油磷脂代谢呈相反模式，提示CCs通过膜脂重塑保护卵母细胞。下调代谢物还富集于铁死亡、GSH和AMPK信号，玻璃化卵母细胞中FTH1下调、AIFM2下调2.7倍，CCs中GSTM3、GPX3和MGST1表达升高，GPX4未见异常表达，AMPK通路富集提示能量平衡紊乱。Cys-Gly是GSH代谢关键二肽中间体，可水解为半胱氨酸和甘氨酸，为GSH再合成提供限速底物。补充Cys-Gly或GSH可改善玻璃化猪卵母细胞质量，表现为促进CC扩展、提高存活、降低ROS/LPO/NO、增加GSH、减少凋亡和自噬，并支持胚胎发育。
研究结论（翻译）：总之，猪GV卵母细胞玻璃化并随后IVM后，卵母细胞中63种代谢物和CCs中91种代谢物显著差异表达。代谢表达变异可能揭示冷冻保存卵母细胞发育潜力降低的机制。整合代谢组和转录组分析显示，玻璃化破坏能量代谢、氧化应激调节和磷脂代谢，这些可能共同损害胚胎发育。补充外源Cys-Gly通过增强CC扩展和改善卵母细胞质量与发育潜力显示出有益效果，为优化玻璃化提供了潜在策略。这些发现为玻璃化GV卵母细胞发育能力降低的代谢基础提供了机制见解，并为改善卵母细胞质量和优化体外培养方案提供了依据。
