云南杜鹃（Rhododendron yunnanense）根际与根内圈微生物组在采样地点和根区室间的分化：基于16S rRNA基因与ITS扩增子测序

《Microorganisms》：Site- and Compartment-Associated Differentiation of Root Microbiomes in Rhododendron yunnanense

根相关微生物组随环境背景和根区室而变化，但这些模式在野生木本植物中仍知之甚少。在本研究中，研究人员利用16S rRNA基因和内转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）扩增子测序，比较了中国云南四个山地采样点云南杜鹃（Rhododendron yunnanense）根际（rhizosphere）和根内圈（root endosphere）的细菌与真菌群落。α多样性（α-diversity）差异主要体现在扩增子序列变异（amplicon sequence variant, ASV）丰富度上，而Shannon和Simpson多样性在采样地点–根区室组合间变化较小。对于细菌和真菌，Bray–Curtis群落组成均与采样地点（sampling site）、根区室（root compartment）及其交互作用显著相关。稳定ASV和核心ASV分析进一步显示，根际与根内圈之间重叠有限。在预先定义的核心标准下，仅三个细菌ASV在区室间共享，而没有真菌ASV符合共享核心成员标准。稳定ASV重叠程度在采样地点间存在变化，并在细菌与真菌群落间存在差异。指示值分析（Indicator-value analysis）、配对丰度检验（paired abundance testing）和随机森林分类（Random Forest classification）共同收敛到一组较小的区室相关属。研究人员保留13个分类学上可解释的属用于正文解读，包括5个与根内圈相关的细菌属和8个真菌属，其中Phialocephala与根际相关。总之，这些结果表明采样地点和根区室均与云南杜鹃根微生物组的明显分化相关。稳定类群和核心类群的低重叠进一步表明根际与根内圈之间存在大量微生物周转，为未来对区室相关类群进行功能验证提供了基础。

研究背景与问题：植物与相关微生物形成紧密联系，根相关微生物组在植物生长和环境响应中发挥重要作用。根际（rhizosphere）与根内圈（root endosphere）是根–土界面的重要区室，其微生物群落受环境背景和根区室共同影响。然而，野生木本植物中这些模式仍认识不足。已有研究多集中于bulk soil或根际，对根际与根内圈微生物组进行配对比较仍相对有限，尤其在木本山地植物中。山地生态系统中海拔常伴随气候、植被和土壤条件变化，但真菌和细菌的响应存在单调、单峰或不显著等差异，表明情境依赖。云南杜鹃（Rhododendron yunnanense）广泛分布于中国西南山地，适合研究不同环境条件下根相关微生物群落。已有杜鹃微生物组研究主要关注土壤或根际沿环境梯度，跨自然山地采样点对根际和根内圈细菌、真菌配对比较，以及共享、稳定、核心类群一致性仍有限。因此，研究人员比较四个采样点野生云南杜鹃根际和根内圈细菌与真菌群落，检验采样地点和根区室与微生物多样性、组成、成员共享及区室相关类群的关系。结论是，二者均与根微生物组明显分化相关，稳定和核心类群低重叠提示根际与根内圈之间大量周转，并识别出供未来功能验证的候选属。

关键技术方法：样本队列来自中国云南四个山地采样点，即Junzishan Mountain、Zhujiangyuan、Ailao Mountain和Huadianba, Cangshan Mountain的野生云南杜鹃，于2023年11月10—20日采集根际与根内圈配对样本，每个采样点保留三对，共24份细菌和24份真菌样本。采用16S rRNA基因V3–V4区和ITS1扩增子测序；使用QIIME 2和DADA2生成ASV，并分别以Greengenes和UNITE数据库进行物种注释。分析包括α多样性、Bray–Curtis主坐标分析（principal coordinate analysis, PCoA）与置换多元方差分析（PERMANOVA）、稳定和核心ASV、指示值分析（Indicator-value analysis）、配对Wilcoxon符号秩检验（paired Wilcoxon signed-rank test）以及随机森林（Random Forest）分类。

研究结果：
3.1 土壤理化背景在采样地点间存在差异：土壤理化测定显示，四个采样点具有不同养分特征。土壤有机质和总氮在Source of the Pearl River最高，在Huadianba, Cangshan Mountain最低；水解性氮呈相似模式。总磷在Junzi Mountain最高，在Source of the Pearl River最低；有效磷从Junzi Mountain到Cangshan Mountain下降；有效钾在Junzi Mountain和Source of the Pearl River较高，在Ailao Mountains和Cangshan Mountain较低；总钾在两个较高海拔点较高。所有土壤均为酸性，pH范围为4.09—5.43，Source of the Pearl River最低，Cangshan Mountain最高。四个采样点呈现不同土壤养分背景，而非所有土壤性质沿海拔一致变化。

3.2 α多样性在采样地点和根区室间变化：基于Chao1、Observed ASVs、Shannon和Simpson指数的分析表明，细菌和真菌α多样性差异主要体现在丰富度指数。Chao1和Observed ASVs通常在根内圈较高，细菌以Ailao Mountains最高，真菌以Cangshan Mountain根内圈最高；Shannon和Simpson指数在多数采样地点–根区室组合间变化较小。各采样点内配对比较经Benjamini–Hochberg校正后未检测到显著的根际–根内圈差异。

3.3 采样地点和根区室与微生物群落组成差异相关：Bray–Curtis PCoA和PERMANOVA显示，细菌群落组成与采样地点（R²=0.182，p=0.001）、根区室（R²=0.133，p=0.001）及其交互作用（R²=0.171，p=0.001）显著相关；真菌群落组成也与采样地点（R²=0.174，p=0.002）、根区室（R²=0.107，p=0.001）及其交互作用（R²=0.147，p=0.010）相关。结果表明，采样地点和根区室均与群落组成变异相关，且根区室关联随采样地点不同。

3.4 根际与根内圈分类组成不同：门水平上，细菌群落主要由Proteobacteria和Actinobacteriota组成，真菌群落主要由Ascomycota和Basidiomycota组成。属水平差异更明显。细菌中Acidothermus、Pseudomonas、Bradyrhizobium和Serratia等较丰富，且分布随采样地点和根区室变化；例如Pseudomonas、Bacillus和Paenibacillus在Junzi Mountain根际较高，Bradyrhizobium和Limosilactobacillus在Source of the Pearl River根际较高，Sphingomonas和Massilia在Ailao Mountains根际较高，Serratia和Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia在Cangshan Mountain根际较高。真菌中Phialocephala、Penicillium、Archaeorhizomyces等较丰富；Serendipita和Oidiodendron在Junzi Mountain根际较高，Mycena和Teratosphaeria在Source of the Pearl River根际较高，Trogia在Ailao Mountains根际较高，Russula、Thelephoraceae相关类群、Membranomyces和Tuber在Cangshan Mountain根内圈较高。属水平谱对采样地点和根区室变化更敏感。

3.5 稳定和核心ASV重叠在根际与根内圈间存在差异：稳定ASV分析显示，细菌在Junzi Mountain有31个根际特异、8个共享和303个根内特异稳定ASV，根际参考重叠比例为20.5%；Source of the Pearl River为27、19和373，重叠比例最高，为41.3%；Ailao Mountains为41、23和819，重叠比例为35.9%；Cangshan Mountain为60、13和335，重叠比例最低，为17.8%。真菌稳定ASV模式不同：Junzi Mountain为9、3和31，重叠比例25.0%；Source of the Pearl River为13、6和44，重叠比例31.6%；Ailao Mountains为27、1和37，重叠比例最低，为3.6%；Cangshan Mountain为7、8和95，重叠比例最高，为53.3%。总体核心分析中，细菌有6个根际核心ASV、33个根内核心ASV，其中3个在两类区室均符合标准；真菌仅有1个根际核心ASV和3个根内核心ASV，没有真菌ASV同时在两个区室符合核心标准。站点特异核心ASV也显示根际与根内圈重叠有限，细菌Jaccard相似性最高为Source of the Pearl River的4.5%，最低为Junzi Mountain的2.4%；真菌最高为Junzi Mountain的7.3%，最低为Ailao Mountains的1.6%。这些结果表明稳定和核心成员在根际与根内圈间重叠有限，且模式随地点和类群变化。

3.6 指示分析识别一致根区室相关属：属水平分析纳入177个细菌属和114个真菌属。指示值分析识别出74个细菌属和11个真菌属与根际或根内圈相关；配对Wilcoxon检验检测到71个细菌属和12个真菌属在区室间丰度差异显著。合并两种方法后得到79个属，包括68个细菌属和11个真菌属。细菌中Acidothermus和Pseudomonas与根际相关，其余许多候选属与根内圈相关；真菌中Phialocephala与根际相关，Linnemannia、Metapochonia、Mortierella、Penicillium、Podila、Saitozyma和Trichoderma与根内圈相关。随机森林分析进一步支持20个细菌属，另48个属仅由指示值分析和配对Wilcoxon检验支持；11个真菌候选属均获得随机森林支持。留一对交叉验证的随机森林模型对细菌和真菌根际与根内圈样本分类AUC均为1.000。最终正文保留13个分类学可解释属，包括5个与根内圈相关的细菌属Anaeromyxobacter、Bdellovibrio、Conexibacter、Bauldia和Candidatus berkiella，以及8个真菌属，其中Phialocephala与根际相关，其余与根内圈相关。Phialocephala在根际平均相对丰度为29.15%，在根内圈为0.31%；Penicillium则从根际0.004%升高至根内圈8.63%。多方法收敛缩小了根区室相关候选属集合。

讨论部分总结：讨论指出，云南杜鹃根相关细菌和真菌群落在采样地点间及根际与根内圈间存在分化。α多样性差异主要反映ASV丰富度，而Shannon和Simpson多样性变化较小。β多样性分析显示采样地点、根区室及其交互作用均与群落组成相关，说明区室相关模式并非在所有采样点一致。稳定和核心ASV重叠有限，表明根际与根内圈之间存在明显微生物周转，真菌低重叠尤为突出。根内圈较高ASV丰富度不应解释为定殖过程中微生物多样性普遍增加，因为不同植物系统或微生物类群中区室α多样性变化并不一致。核心成员定义依赖类群出现频率和丰度一致性，因此没有共享真菌核心ASV并不意味着没有真菌ASV同时出现在两个区室，而是其未同时满足两个区室的核心阈值。指示分析结合配对丰度检验和随机森林分类，降低了对单一分析标准的依赖；部分细菌属在其他植物根相关群落中也有报道。真菌候选属多与根内圈相关，而Phialocephala在云南杜鹃中与根际强相关；但属水平偏好不宜视为固定，根定殖真菌生活方式可随宿主和环境变化，因此这些属应视为区室相关候选，而非功能已定义成员。采样点差异可能与局地环境背景有关，但土壤理化性质以站点水平描述，未与单个微生物样本一一匹配，因此不能作为样本级土壤驱动因子；地理因素应解释为采样地点身份，而非独立重复处理。研究限制包括每个环境仅有一个地理采样点、每站点–区室组合仅三个生物学重复、土壤变量未匹配、16S rRNA基因和ITS扩增子测序主要提供分类和相对丰度信息、随机森林性能仅在本数据集内评估。未来需更大样本、更多地理重复、匹配环境测量、分离接种和功能潜力或活性测定，以检验区室相关属的生态作用。

研究结论翻译：本研究表明，云南杜鹃根相关微生物组在采样地点间以及根际与根内圈间存在差异。α多样性差异主要反映ASV丰富度，而Shannon和Simpson多样性在采样地点–根区室组合间变化较小。细菌和真菌群落组成均与采样地点、根区室及其交互作用相关。稳定和核心ASV分析进一步揭示根际与根内圈之间重叠有限，表明根区室间微生物成员存在大量周转。该模式在采样地点间变化，并在细菌与真菌间不同。通过结合指示值分析、配对丰度检验和随机森林分类，研究人员进一步识别出一组较小且一致地与根际或根内圈相关的属。总之，这些发现表明采样地点和根区室均与R. yunnanense根微生物组变异相关。稳定和核心类群的低重叠突出根际与根内圈微生物组成不同。此处鉴定的区室相关属为未来分离和接种实验提供候选，但其在R. yunnanense中的生态作用仍需直接检验。