《iScience》：Single-nucleus transcriptomics uncovers region-specific molecular features underlying selective aging vulnerability of cholinergic neurons
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胆碱能神经元（cholinergic neurons）在基底前脑（basal forebrain, BF）、中脑（midbrain, MB）和脑干（brainstem, BS）中表现出功能和分子异质性，而其衰老相关转录特征仍表征不足。在此，研究人员对成年和老年
胆碱能神经元（cholinergic neurons）在基底前脑（basal forebrain, BF）、中脑（midbrain, MB）和脑干（brainstem, BS）中表现出功能和分子异质性，而其衰老相关转录特征仍表征不足。在此，研究人员对成年和老年小鼠的MS/VDB、HDB/SI、PPTG/LDTG、7N和12N中的108,062个细胞核进行了单核RNA测序（single nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）。BF细胞比MB和BS细胞表现出更显著的衰老相关转录组改变，且胆碱能神经元存在明显的区域特异性差异。细胞间通讯分析揭示了BF特异性的APP（amyloid precursor protein，淀粉样前体蛋白）和ApoE（apolipoprotein E，载脂蛋白E）信号衰老相关变化。在这种改变的环境中，内在转录反应在不同脑区存在差异。在衰老的BF胆碱能神经元中，转录反应以氧化应激和炎症特征增加以及参与神经元结构维持的基因表达减少为特征。相反，MB和BS胆碱能神经元维持相对稳定的转录谱。这些发现揭示了细胞外信号与内在转录应激之间的区域特异性关联，强调了一种选择性失衡，其构成了BF胆碱能神经元易感性的基础。
研究背景：胆碱能神经元对脑功能调控和神经环路兴奋-抑制平衡至关重要，按神经发育起源、解剖定位和环路功能可分为BF、MB和BS等系统。衰老和阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）中胆碱能神经元退变受到关注，影像学证据提示衰老对脑功能影响具有区域特异性，BF胆碱能神经元对衰老和神经退行性疾病呈选择性易感，而MB和BS胆碱能神经元在衰老中相对保留。现有转录组研究多聚焦BF，MB和BS研究多为通路特异性或区域局限，因此尚不清楚衰老是否诱导共享或区域特异性转录程序。研究人员因此开展单细胞水平系统比较，以揭示BF、MB和BS胆碱能神经元衰老易感性差异的分子基础。
研究人员对成年和老年小鼠BF、MB、BS特定亚区进行snRNA-seq，获得108,062个高质量细胞核，鉴定主要细胞类型，比较衰老相关差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）、细胞间通讯、胆碱能神经元区域身份、年龄相关共表达模块及候选基因扰动，得出BF胆碱能神经元衰老易感性更高，表现为APP/ApoE信号改变、氧化应激和炎症特征增强、神经元结构维持程序下调，而MB和BS相对稳定。该研究为胆碱能系统区域选择性衰老易感性提供了转录组证据。
关键技术方法（≤250字）：研究使用10× Genomics平台进行snRNA-seq，样本来自C57BL/6J小鼠，成年组3–5月龄、老年组18–24月龄，每个脑区及年龄组取8只小鼠（4雄4雌）组织合并建库；目标区域包括MS/VDB、HDB/SI、PPTG/LDTG、7N和12N。数据分析采用Seurat、CellChat、hdWGCNA、GSVA、scTenifoldKnk虚拟基因敲除，并以RNAscope原位杂交验证关键基因表达。
研究结果：
1. Major cell types are identified across the BF, MB, and BS（在BF、MB和BS中鉴定主要细胞类型）：通过snRNA-seq鉴定11种主要细胞类型，包括GABA能神经元、谷氨酸能神经元、胆碱能神经元、少突胶质细胞、少突胶质前体细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、内皮细胞、室管膜细胞、周细胞和成纤维细胞。区域间细胞类型比例存在差异，MB和BS中谷氨酸能神经元和少突胶质细胞比例高于BF，GABA能神经元比例较低。层次聚类显示BF谷氨酸能和GABA能神经元区域特异性更强，胆碱能神经元形成独立分支，区域特异性最显著。衰老DEG分析显示，BF老年组上调DEG富集p53介导炎症反应、氧化磷酸化、突触翻译和蛋白合成，而MB和BS老年组未见类似协调激活；三区下调DEG共同涉及轴突导向、神经元维持或凋亡相关通路。
2. Aging alters intercellular communication in a region-specific manner（衰老以区域特异性方式改变细胞间通讯）：CellChat分析显示，BF中ApoE信号在成年和老年均保持高通讯强度，小胶质细胞为主要接收细胞，接收包括胆碱能神经元在内的多种细胞ApoE输入，且ApoE信号激活限于BF。BS老年组中IGF信号特异激活，MB老年组中PCDH信号激活。APP信号在BF、MB和BS均存在，胆碱能神经元为潜在接收细胞；BF老年组APP信号重要性评分显著增加，MB老年组呈上调趋势，BS无显著增加。配体-受体对包括App-Sorl1和App-Tnfrsf21，BF中经App-Tnfrsf21的通讯概率增强。
3. Cholinergic neurons exhibit distinct regional transcriptional identities（胆碱能神经元表现出不同的区域转录身份）：胆碱能神经元无偏亚聚类按解剖来源分离，MB和BS胆碱能神经元彼此更接近。BF胆碱能神经元高表达Lhx8、Ngfr和Ntrk1，MB富集Tgfbr2、Egflam和Nos1，BS表达Sv2b、Ryr3和Nfia。RNAscope验证Ngfr在BF胆碱能神经元高特异表达，几乎全部BF胆碱能神经元表达Ngfr，而MB和BS几乎不表达；BF胆碱能神经元中CamK2a阳性比例高于MB和BS。功能富集显示，BF特异基因与神经退行性疾病、突触信号和神经元投射发育相关，MB特异基因与一氧化氮信号、Wnt和MAPK通路相关，BS特异基因与长寿调节、PI3K-Akt和Rap1信号相关。hdWGCNA模块hub基因与区域标记基因一致。
4. Cholinergic neurons display region-specific aging-associated molecular programs（胆碱能神经元显示区域特异性衰老相关分子程序）：hdWGCNA识别年龄相关共表达模块，BF中turquoise模块正相关年龄、pink模块负相关年龄，MB中black模块正相关年龄，BS中brown模块负相关年龄且无正相关模块。BF turquoise模块富集神经退行性疾病、氧化磷酸化、ATP生物合成和凋亡信号；MB black模块与RNA加工、核转运和染色质重塑相关；BS brown模块富集神经元迁移、轴突导向、神经递质转运和突触调节。GSVA显示BF胆碱能神经元随年龄上调氧化磷酸化、p53介导DNA损伤反应和凋亡信号等应激通路；MB和BS中代谢稳态和生长信号如p38 MAPK级联负调控、胰岛素受体回收、胰岛素反应葡萄糖摄取和IGF1信号上调，而BF中下调。
5. Age-related transcriptional changes in cholinergic neurons are largely region specific（胆碱能神经元的年龄相关转录变化 largely 区域特异性）：比较成年和老年胆碱能神经元DEG发现，BF和BS的DEG数量明显高于MB。UpSet分析显示区域间重叠有限，BF老年组特异上调186个基因，包括Apoe、Malat1和Atp5o，特异下调92个基因，包括Nf1、Camk2d和Tubb3；BS老年组特异上调261个基因如Isl1和Pax2，特异下调380个基因；MB未检测到区域特异DEG。部分基因方向相反，如Ammecr1、Csmd2os和Grm3在BF老年组上调而BS老年组下调，Ptprs、Csmd1和Ints6l趋势相反。BF特异上调基因富集核糖体生物发生、突触翻译和信号转导；BF老年组下调而BS老年组上调的过程主要与神经元结构和功能维持相关。BS老年组上调离子稳态、能量代谢、细胞骨架组织和细胞存活，BF老年组下调轴突和胞质运输、神经营养信号、脂膜代谢、胞体-突触结构和细胞外基质支持。基因集评分显示BF胆碱能神经元多个胞体结构维持基因集随年龄显著下调，BS中离子稳态、能量代谢、细胞骨架维持和细胞存活显著上调。
6. Oxr1 and Ptprs are linked to neuronal structural and synaptic programs in BF cholinergic neurons（Oxr1和Ptprs与BF胆碱能神经元结构和突触程序相关）：Oxr1和Ptprs在BF和BS呈相反表达模式。Oxr1是抗氧化应激相关蛋白，BF胆碱能神经元随衰老显著上调，BS显著下调，且BF中上调具细胞类型特异性。Ptprs属于受体型蛋白酪氨酸磷酸酶家族，参与轴突生长、神经元黏附和突触形成，BF胆碱能神经元随衰老显著下调，BS呈上调趋势。scTenifoldKnk虚拟敲除显示，Oxr1-KO鉴定81个扰动基因，其中22个为年龄相关DEG和氧化应激模块hub基因，如Nrg3os和Ube3a，富集ERK1/ERK2级联、突触组装和神经元投射延伸，GSEA富集轴突发育、神经元投射形态发生和突触组织调节。Ptprs-KO鉴定69个扰动基因，包括Nfib、Reln和13个年龄相关DEG，富集轴突神经元投射导向、突触组装和调节性神经递质循环，GSEA与突触组织和突触信号转导相关。
讨论部分总结：讨论指出不同解剖位置胆碱能系统在发育起源、投射模式及衰老变化上不一致。形态学研究提示BF胆碱能神经元对衰老最敏感。该研究用snRNA-seq分析BF、MS和BS亚区，发现胆碱能神经元具有独特区域分子特征。BF特异表达Ngfr和Ntrk1，正常衰老中Ntrk1（TrkA）显著降低而Ngfr相对稳定。CellChat显示BF中ApoE网络活跃，小胶质细胞为主要接收者，提示ApoE介导的神经元-胶质相互作用及脂代谢和炎症相关细胞外信号环境。BS老年组IGF信号增强，可能为区域特异性保护或代偿机制。APP信号所有区域存在，但BF胆碱能神经元随年龄接收增强，而其他细胞类型信号减弱，MB和BS无此变化。hdWGCNA和GSVA提示BF胆碱能神经元与神经退行性、氧化磷酸化、ATP产生和凋亡信号相关，MB和BS更多涉及RNA加工、染色质重塑和代谢稳态。DEG高度区域特异，BF最脆弱，结构完整性、轴突运输、神经营养支持和突触维持下调，应激和翻译通路上调；BS显示适应特征，但许多BS胆碱能神经元为直接支配外周肌肉的运动神经元，其细胞身份和功能需求差异可能影响衰老反应。Oxr1和Ptprs敲除均导致神经元结构和突触组织网络趋同紊乱，提示应激反应和神经元维持程序协调变化可能与BF胆碱能神经元分子易感性增加相关。研究局限包括：组织混合建库限制动物水平重复统计，转录组结论需功能验证，雄雌组织混合无法严格评估性别特异性效应；未来需独立生物学重复、功能扰动和纵向研究验证Ptprs、Oxr1等候选基因。
研究结论翻译：这些发现揭示了细胞外信号与内在转录应激之间的区域特异性关联，强调了一种选择性失衡，其构成了BF胆碱能神经元易感性的基础。总之，这些结果表明，应激反应和神经元维持相关转录程序的协调变化可能与衰老过程中BF胆碱能神经元分子易感性增加有关。
