《Agronomy》：Early Detection of the Seed-Borne Tobamoviruses Tomato Brown Rugose Fruit Virus and Tomato Mosaic Virus Using Portable Raman Spectroscopy
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番茄因其高营养价值而成为全球广泛栽培的蔬菜作物之一，但其生产受到包括真菌、细菌、植原体、病毒和类病毒在内的多种病原体的严重影响。其中，番茄花叶病毒（tomato mosaic virus, ToMV）和番茄褐色皱纹果病毒（tomato brown rugose
番茄因其高营养价值而成为全球广泛栽培的蔬菜作物之一，但其生产受到包括真菌、细菌、植原体、病毒和类病毒在内的多种病原体的严重影响。其中，番茄花叶病毒（tomato mosaic virus, ToMV）和番茄褐色皱纹果病毒（tomato brown rugose fruit virus, ToBRFV）均属于烟草花叶病毒属（Tobamovirus，豇豆花叶病毒科 Virgaviridae），由于其病毒粒子的异常稳定性及其在种皮上的持久性，构成了重大威胁。这一特性促进了种子到幼苗的传播，并导致病毒扩散。利用快速、非破坏性且经济高效的诊断技术对ToMV和ToBRFV进行早期检测，对于番茄苗圃中认证种植材料的可持续生产至关重要。本研究使用便携式手持设备，探索了拉曼光谱（Raman spectroscopy, RS）检测新生番茄幼苗中ToMV和ToBRFV感染的潜力。为模拟自然的种子到幼苗传播，播种前将种子人工污染纯化的ToMV或ToBRFV病毒粒子。从每株幼苗的第一片真叶采集拉曼光谱，并通过DAS-ELISA鉴定病毒感染植株后，将感染植株与健康未处理对照植株的光谱进行比较。病毒感染与分配给类胡萝卜素、脂肪族化合物、苯丙烷类、果胶、木质素和纤维素的峰强度显著降低相关。这些发现证明了手持式RS在快速、非破坏性早期检测番茄幼苗中ToMV和ToBRFV感染方面的有效性，表明该方法在支持认证种植材料生产和改善苗圃及生产系统中的病害管理方面具有巨大潜力。
研究背景与科学问题
番茄是全球第二大栽培蔬菜作物，年产量约1.88亿吨，主要得益于其果实富含维生素和抗氧化剂的高营养价值。然而，番茄生产受到超过300种已知病毒物种的严重制约，其中种子传播和种传病毒尤为值得关注，因为垂直传播使受感染植株从生长初期就成为长期接种物储库，导致病毒可能在症状出现前就已悄然扩散，极大增加了早期检测和有效防控的难度。在番茄致病病毒中，烟草花叶病毒属（Tobamovirus）病毒，特别是番茄花叶病毒（ToMV）和番茄褐色皱纹果病毒（ToBRFV），因其病毒粒子极其稳定、可通过机械方式传播并在土壤、农具和种子上持续存留，对全球番茄生产构成重大威胁。ToMV分布广泛，引起叶片花叶、褪绿、畸形及果实着色不均等症状；ToBRFV则是2014-2015年首次在以色列和约旦露地番茄作物中发现的新兴病原，可克服所有已知的番茄抗性基因（包括Tm-1、Tm-2和Tm-22），目前在超过50个国家有记录，发病率高达50%-100%，可导致高达55%的产量损失。两种病毒均为种传和种子可传播病毒，种子到幼苗的传播发生在萌发过程中种皮形成的微损伤处。
当前植物病原体的检测和鉴定主要依赖血清学和分子生物学技术，如ELISA和PCR，但这些方法耗时且不易适应田间现场诊断。更先进的宏基因组学等方法虽可实现精确分子鉴定，但目前成本高昂、具有破坏性且需要专门的生物信息学专业知识，不适合大规模诊断。因此，迫切需要开发可持续、快速、非破坏性且能在早期阶段检测病原体的创新方法。拉曼光谱（RS）作为一种新兴的非破坏性诊断工具，已被实验验证可用于检测不同作物中的细菌感染、虫害、真菌病害和多种病毒感染，其原理是病原感染会改变植物组织的生化组成，导致拉曼光谱特征发生变化。
研究方法概述
研究人员采用人工种子接种法模拟自然种传途径：将Marmande和York两个品种的番茄种子浸泡水合后，分别与纯化的ToMV（IFA9分离株）或ToBRFV（Tom1-Jo分离株）病毒粒子孵育2小时，随后播种于装有混合基质的育苗盘中。待幼苗第一片真叶展开后，使用便携式手持Zolix Finder Edge拉曼光谱仪（配备1064 nm激光源），在200-2000 cm-1光谱范围、14 cm-1分辨率条件下采集叶片基部三个不同位点的光谱。一个月后，通过双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）鉴定感染植株，以此定义用于光谱比较的数据集。光谱数据经基线校正后，采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）评估基因型（G）、感染（I）及其交互作用（G × I）对拉曼峰强度的影响，并使用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）建立分类模型，通过5折分层分组交叉验证评估模型性能。
研究结果
3.1 ToMV和ToBRFV感染植株的鉴定与数据集定义
所有种子均成功发芽，但部分幼苗未能继续发育。Marmande品种经ToMV和ToBRFV处理后存活率分别为56%和63%；York品种则分别为63%和40%。所有未处理的对照种子均成功生长。DAS-ELISA检测结果显示，Marmande品种中ToMV和ToBRFV的感染率分别为53%和42%；York品种则分别为82%和92%。值得注意的是，在此阶段，来自病毒处理种子的植株叶片与健康对照在视觉上无法区分。这种种子接种程序使研究人员能够在完全无症状的幼苗第一片真叶上获取拉曼光谱，这是传统机械摩擦接种无法实现的。
3.2 拉曼光谱分析
平均拉曼光谱显示，与健康对照相比，病毒感染植株中与类胡萝卜素、脂肪族化合物、纤维素、果胶、苯丙烷类和木质素相关的峰强度显著降低，这种变化在York品种中更为明显。双因素方差分析结果表明：
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类胡萝卜素相关峰（999-1004、1150-1155、1179-1185和1517-1522 cm-1）：感染效应具有基因型依赖性，两种品种中感染均导致拉曼强度显著下降，但York品种的降幅大于Marmande。
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脂肪族化合物相关峰（965、1283、1375-1385和1434-1444 cm-1）：在965和1375-1385 cm-1处，两种品种均观察到感染导致的强度降低；但在1283 cm-1处仅York植株出现显著降低，而在1434-1444 cm-1处York的降幅大于Marmande。
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纤维素相关峰：感染导致两种品种的拉曼峰强度均显著下降，且无显著的基因型×感染交互作用，表明两种品种对感染的反应相似。
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果胶、苯丙烷类和木质素相关峰：果胶相关峰的强度在两种品种中均因感染而降低，但York降幅更大；苯丙烷类相关峰仅在York中显著降低；木质素相关峰在York中显著降低，而在Marmande中仅有有限且不显著的变化。
值得注意的是，在任何一种品种中，ToMV和ToBRFV感染植株之间的平均峰强度均未观察到统计学显著差异，表明这两种病毒在检测的极早期感染阶段可能诱导了类似的代谢响应。基于此，研究人员将两种病毒感染植株的光谱合并为一个“感染”类别，分别针对每个品种建立了PLS-DA分类模型。York品种模型的交叉验证AUC为0.82±0.10，准确率为0.74±0.13，灵敏度为0.78±0.15，特异度为0.67±0.24；Marmande品种模型的AUC为0.77±0.10，准确率为0.68±0.10，灵敏度为0.72±0.19，特异度为0.63±0.22。
讨论与结论
研究表明，RS能够快速、非破坏性地检测到病毒感染引起的类胡萝卜素、脂肪族化合物、苯丙烷类、果胶、纤维素和木质素等代谢和结构成分的变化。类胡萝卜素含量下降与先前在番茄斑萎病毒（TSWV）感染番茄中的观察一致，反映了病毒对宿主类胡萝卜素代谢的干扰。脂肪族和苯丙烷类化合物的变化可能与病毒诱导的脂质代谢重组和次生代谢产物调控有关。果胶相关峰的降低可能源于烟草花叶病毒属病毒通过移动蛋白（MP）与果胶甲酯酶相互作用，调节胞间连丝通透性而导致细胞壁代谢的改变。尽管RS检测到的代谢变化可能与环境和营养胁迫重叠，但这恰好可用于评估幼苗的整体健康状况。鉴于当前种子检疫实践因灵敏度和病毒分布不均匀等问题无法完全排除引入感染植株的风险，对幼苗进行早期筛查可作为补充策略。
结论部分翻译：总之，尽管人工接种策略可能使种子接触的病毒接种量高于自然种子到幼苗传播条件，但本研究为商业番茄移栽苗圃中种传和种子可传播病原体的综合管理策略开发提供了有价值的基础。RS可作为一种快速、非破坏性且经济高效的筛查工具，用于早期检测潜在感染的幼苗，补充传统的病原特异性诊断方法，有助于生产更健康的繁殖材料。虽然健康和感染幼苗之间观察到的光谱差异支持RS检测感染相关代谢变化的能力，但PLS-DA模型的分类性能仅通过内部植株水平交叉验证进行评估，且健康对照植株数量相对有限。因此，需要在更大植株群体中进行独立的盲法验证研究，以确认该方法在实际操作条件下的诊断适用性。
